作者
Chava Pocernich，Jolita Uthe，Steve Siembieda 安捷倫科技有限公司

​​摘要
Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)采用革命性設(shè)計(jì)，是唯一一款能夠自動(dòng)進(jìn)行高分子量 (HMW) gDNA 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE) 分析的儀器。與傳統(tǒng) PFGE 分析相比，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)能夠在更短時(shí)間內(nèi)對(duì) gDNA 分子量和完整性進(jìn)行定性分析。應(yīng)用領(lǐng)域涵蓋三代測(cè)序或長讀長測(cè)序平臺(tái)的小基因組分析到復(fù)雜基因組從頭組裝，這些應(yīng)用要求 HMW gDNA 樣品滿足高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。有多種方法針對(duì)特定的下游應(yīng)用從選取的真核和原核來源樣品中分離 gDNA。而分離 gDNA   的分子量和質(zhì)量會(huì)受到不同提取方法的影響，因此需要對(duì) gDNA 樣品進(jìn)行可靠的質(zhì)量評(píng)估。安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒專為 Femto Pulse 系統(tǒng)上的 HMW gDNA 分離而設(shè)計(jì)，可提供準(zhǔn)確而重現(xiàn)的分子量和質(zhì)量評(píng)估。利用基因組 DNA 165 kb 分析試劑盒在 Femto Pulse 系統(tǒng)上對(duì)比五種不同gDNA 提取方法得到的gDNA 分子量和質(zhì)量。

前言
大片段基因組文庫（如用于10X Genomics、Oxford Nanopore 和 PacBio Technologies 的文庫）需要起始基因組 DNA (gDNA) 滿足特定質(zhì)量條件才能成功獲得結(jié)果。影響樣品質(zhì)量的幾個(gè)因素包括：提取方法、樣品儲(chǔ)存、反復(fù)凍融循環(huán)和變性^[1]。在提取和處理 gDNA  期間，DNA  可以在許多不同環(huán)節(jié)發(fā)生物理、酶促和化學(xué)剪切，變?yōu)樾∑�段。因此，�?zhǔn)確可靠的 gDNA 質(zhì)量評(píng)估對(duì)于這些下游測(cè)序過程的成功至關(guān)重要。通過確定樣品的片段化和降解程度，部分評(píng)估 gDNA 質(zhì)量。過夜脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE) 通常用于評(píng)估高分子量 (HMW) gDNA 的完整性。配備基因組DNA 165 kb 試劑盒的 Femto Pulse 系統(tǒng)是市面上唯一一款用自動(dòng)分離系統(tǒng)替代 PFGE 的解決方案，可在短短 70 分鐘內(nèi)評(píng)估 HMW gDNA。

實(shí)驗(yàn)部分
將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) 菌株 BY4741（ Dharmacon，部件號(hào)YSC1048）在 YPD 肉湯培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司，部件號(hào) A1374501）中培養(yǎng) 24 小時(shí)。離心收集細(xì)胞，再按照若干種方案提取 gDNA。方法 A 采用經(jīng)典的苯酚-氯仿-異戊醇 (25:24:1)（賽默飛世爾科技公司，部件號(hào) AC327111000）提取方案^[2]，方法 B、C、D、E 根據(jù)以下四種不同市售試劑盒的制造商說明書進(jìn)行：

Wizard 基因組 DNA 純化試劑盒（Promega Life Sciences，部件號(hào) A1120）、Quick- DNA 通用試劑盒（Zymo Research，部件號(hào) D4068T）、MegaLong gDNA 試劑盒（G-Biosciences，部件號(hào) 786-146）、Genomic-tip 20/G 以及基因組 DNA 緩沖液組合（Qiagen，部件號(hào) 10223 和19060）。方法 B 是液相提取，方法 C 和 E 是離心柱提取，方法 D 是膜提取。分別通過 PFGE 以及在配備安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒（部件號(hào) Fp-1002-0275） 的 Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)（部件號(hào)FPv1-CE2）上采用 FP-1002-22 gDNA 165 kb 方法（快速法）或 FP-1002E22 擴(kuò)展 gDNA 165 kb 法（擴(kuò)展法），對(duì)提取的 gDNA 進(jìn)行分離。在 Femto Pulse 系統(tǒng)操作軟件中選擇基因組 DNA 165 kb 快速和擴(kuò)展法。將 50 ng/µL 左右 gDNA上樣至 0.8% 瓊脂糖凝膠（Lonza SeaKem Agarose，部件號(hào) 50152），并用 Pippin- Pulse 預(yù)設(shè)方案（ 5 至 150 kb）通過PFGE 分離 18 小時(shí) (Sage Sciences)。使用 Agilent FP 165 kb 分子量標(biāo)準(zhǔn)品（165、50、42、23、21、17.7、10   kb）（部件號(hào) FP-7002-U035）和低范圍 PFG 標(biāo)準(zhǔn)品（New England Biolabs，部件號(hào)N0350S）。分離后，用 Agilent FP 嵌入染料（部件號(hào) FP-6001-U030）對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行后染色，并用紫外透照儀觀察。

結(jié)果與討論
在 Femto Pulse 系統(tǒng)上用快速和擴(kuò)展基因組 DNA 165 kb 方法測(cè)定分子量分布
Femto Pulse 系統(tǒng)軟件為基因組 DNA165 kb 試劑盒提供了兩種分離方法�？焖俜ㄊ且环N 70 分鐘的脈沖場(chǎng)毛細(xì)管電泳 (CE) 分離，最適合對(duì) 80 kb 以下的 gDNA 樣品進(jìn)行分離與分子量測(cè)定。擴(kuò)展法采用另一種持續(xù) 3.5 小時(shí)的脈沖場(chǎng) CE 分離方法，專用于改善大于 80 kb 的 gDNA 樣品的分離和分子量測(cè)定。用快速法分離的大于 80 kb 的基因組 DNA 峰形尖銳、緊湊，與 165 kb 左右 DNA 的片段峰形相似^[3]。導(dǎo)致這一結(jié)果的部分原因?yàn)槊}沖場(chǎng)分離期間用于樣品分離的時(shí)間太短。擴(kuò)展法在更長的分離時(shí)間中使用了脈沖場(chǎng) CE 替代方法，并將相同 gDNA 樣品分離為更寬的彌散條帶，更能代表樣品的整體分子量范圍。擴(kuò)展法推薦用于大于 80 kb 的 gDNA 樣品（快速法僅能將其分離為 165 kb 左右的緊湊峰）。



Femto Pulse 系統(tǒng)使用基因組 DNA 165 kb擴(kuò)展法來分離大于 80 kb 的提取 gDNA（圖 1）。使用 Agilent ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件上的 Smear Analysis 選項(xiàng)卡分析 gDNA 的分子量分布。彌散條帶分子量分布包含整個(gè)彌散條帶范圍內(nèi)的濃度分布。酵母 gDNA 的彌散條帶分子量分布和完整性隨使用的提取方法不同而變化。使用提取方法 A、B、C、D、E 得到的基因組 DNA 樣品的彌散條帶分子量依次減小（表 1）。液相提取法 A 和 B 得到了分子量最大的完整 gDNA 彌散條帶。用傳統(tǒng)液體苯酚-氯仿提取法 (A) 提取的基因組 DNA 產(chǎn)生的完整 gDNA 較長，平均為163670 bp，而另一種液相提取方法 B 為
103111 bp。方法 C 離心柱 gDNA 提取方法和方法 D 膜 gDNA 提取方法，在五種不同提取方法中表現(xiàn)出相似的彌散條帶分子量分布結(jié)果。



在使用基因組 DNA 165 kb 擴(kuò)展法分析時(shí)，方法 E 離心柱 gDNA 提取方法得到的電泳圖顯示整個(gè) gDNA 樣品均分子量小于 80 kb。因此，將使用快速法和擴(kuò)展法分析的方法 E 樣品進(jìn)行對(duì)比（圖 2）。兩種方法對(duì)樣品 E 得到的彌散條帶分子量相近，為 30579 和 27388 bp（分別對(duì)應(yīng)于快速法和擴(kuò)展法）。在此示例中， 1 小時(shí)的快速法運(yùn)行時(shí)間更短，故優(yōu)于擴(kuò)展法。



Femto Pulse 系統(tǒng)與脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (PFGE) 的對(duì)比
過去，16 至 18 小時(shí)的 PFGE 分析是測(cè)定 50 kb 以上 gDNA 質(zhì)量和分子量的唯一選擇。隨著技術(shù)的進(jìn)步，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)成為唯一一款能夠在短短 70 分鐘內(nèi)評(píng)估 165 kb 以內(nèi) gDNA 分子量和質(zhì)量的儀器。用 Femto Pulse 系統(tǒng)取代過夜運(yùn)行的 PFGE，省去了數(shù)天專門用于質(zhì)量控制檢查的時(shí)間，從而節(jié)省了時(shí)間和金錢。ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件自動(dòng)提供峰分子量、電泳圖和數(shù)字化膠圖，實(shí)現(xiàn)樣品質(zhì)量和分子量的快速測(cè)定。相比之下，PFGE 運(yùn)行需要采用額外軟件進(jìn)行用戶評(píng)估，以獲得計(jì)算分子量值。此外，F(xiàn)emto  Pulse 系統(tǒng)將樣品起始量降至皮克級(jí)，節(jié)省了寶貴的樣品材料。
 
對(duì)于測(cè)試的所有提取方法，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)擴(kuò)展法與 PFGE 凝膠得到的 ProSize 數(shù)字化膠圖中的 gDNA 濃縮條帶區(qū)域具有相近的分子量（圖 3）。Femto Pulse 系統(tǒng)的高靈敏度使其能夠檢出因濃度低而無法在 PFGE 上檢出的完整 gDNA 彌散條帶范圍。此外，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)的出色分
辨率有助于區(qū)分用方法 B、C、D 提取的分子量相近的gDNA 樣品。

基因組質(zhì)量值 (GQN)
提取 DNA 的質(zhì)量會(huì)因?yàn)樘崛》椒ā�樣品處理和組織類型的不同產(chǎn)生很大差異。因此，在使用樣品前通過質(zhì)量控制分析來確定高度完整的 gDNA 十分重要。基因組質(zhì)量值 (GQN) 專為 ProSize 設(shè)計(jì)，可以輕松
實(shí)現(xiàn)定制化的 gDNA 質(zhì)量評(píng)估。用戶可針對(duì)其特定應(yīng)用設(shè)定合適的分子量閾值。然后，ProSize 根據(jù)高于指定分子量閾值的總測(cè)量濃度分?jǐn)?shù)計(jì)算 GQN 值。GQN 以 0 到 10 的等級(jí)對(duì)樣品進(jìn)行評(píng)分，0 表示樣品均未超過閾值，10 表示 100% 的樣品高于閾值。

在需要分析不同分子量的 gDNA 時(shí)，能設(shè)置可自定義的 GQN 分子量閾值是一項(xiàng)巨大的優(yōu)勢(shì)。用戶可以根據(jù)具體樣品確定合適的分子量閾值，以便客觀判斷哪些樣品可滿足用戶要求。將方法 A、B、C、D、
E 提取的酵母 gDNA 的 GQN 分子量閾值設(shè)為 50 kb。隨著 gDNA 樣品分子量的減小，GQN 分別為 8.2、7.4、6.1、3.0、1.1（分別對(duì)應(yīng)于方法 A、B、C、D、E， 表 1），與預(yù)期相同。GQN 還表示高于分子量閾值的樣品百分比。例如，GQN 8.2 表示高于 50 kb 閾值的樣品占 82%。也就是說，有 18% 的樣品低于閾值。方法C 和 D 得到的分子量相近（分別為 77 和 62 kb），但得到的 GQN 分別為 6.1 和
3.0，差異很大。GQN 所反映出的差異主要是由于彌散條帶分布不同，因此相近平均分子量的 gDNA 的質(zhì)量水平不同。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應(yīng)用的樣品時(shí)，需要同時(shí)考慮樣品的分子量和質(zhì)量。

結(jié)論
Agilent Femto Pulse 系統(tǒng)是唯一能夠替代 HMW gDNA 過夜 PFGE 分析的自動(dòng)化系統(tǒng)，可以在 70 分鐘內(nèi)完成分析，大大節(jié)省時(shí)間和金錢。此外，F(xiàn)emto Pulse 系統(tǒng)將樣品起始量降至皮克級(jí)，節(jié)省了寶貴的樣品材料。Agilent ProSize 數(shù)據(jù)分析軟件能夠報(bào)告用戶定義的 GQN 質(zhì)量評(píng)分，該評(píng)分客觀代表了每個(gè)樣品中 HMW gDNA 的百分比。在確定最佳 gDNA 提取方法和適用于下游應(yīng)用的樣品時(shí)，同時(shí)需要考慮樣品分子量和質(zhì)量。使用 Femto Pulse 系統(tǒng)和安捷倫基因組 DNA 165 kb 試劑盒對(duì)比了通過不同方法提取的 DNA 樣品的分子量和質(zhì)量。與其他液相、離心柱和膜提取方法相比，傳統(tǒng)酚-氯仿提取方法得到的 gDNA 最長且最完整。Femto Pulse 系統(tǒng)具有極高的分辨率，可以區(qū)分平均分子量相近的 gDNA 樣品間的不同分子量分布，這是傳統(tǒng)PFGE 無法實(shí)現(xiàn)的功能。

參考文獻(xiàn)
<sup>1. Pocernich, C.; Uthe J.; Wong K-S. Quality Assessment of Genomic DNA for Biobanking Samples（用于生物樣本庫樣品的基因組 DNA 質(zhì)量評(píng)估），安捷倫科技公司應(yīng)用簡報(bào)， 出版號(hào) 5994-0520ZHCN，2018
2. Fan, H.; Gulley, M. L. DNA Extraction from Fresh or Frozen Tissues.In Methods in Molecular Medicine: Molecular Pathology Protocols, Killeen, A. A., Ed.; Humana Press Inc., Totowa, NJ, 2001; vol. 49, pp 5–10
3. Pocernich, C.; Uthe, J.; Wong, K-S. Genomic DNA Sizing andQuality Control on the Agilent FemtoPulse System（在 Agilent FemtoPulse 系統(tǒng)上進(jìn)行基因組 DNA 分子量測(cè)定與質(zhì)量控制），安捷倫科技公司應(yīng)用簡報(bào)，出版號(hào) 5994-0516EN，2017


僅限研究使用。不可用于診斷目的。
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2019 年 3 月 5 日，中國出版
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5994-0754ZHCN</sup>