國自然沖刺2：蛋白翻譯后修飾的基金申請解析與研究注意點

瀏覽次數(shù)：4337　發(fā)布日期：2019-3-6　

每年三月初，都是科研界的“高考”倒計時，因為距離國自然基金申請的截止日期已不到半月�？v觀歷年國自然申請情況，蛋白的翻譯后修飾都是申請中重大研究方向之一。2018年國自然統(tǒng)計表明，磷酸化、泛素化、乙�；刃揎椀南嚓P(guān)基金項目，總研究資助金額超過2億。

繼上周的腸道微生物研究方案解析后（國自然沖刺：打通菌群多樣性與功能的研究策略），本周我們再抓緊時間為各位老師分享一下國自然中各類修飾的趨勢分析及組學(xué)研究的注意事項，以期為各位老師提供幫助。下面我們主要關(guān)注三種最常規(guī)研究的修飾類型——磷酸化修飾、泛素化修飾和乙�；揎棥�

表現(xiàn)穩(wěn)定：磷酸化——全能調(diào)控之王

磷酸化是修飾中的全能調(diào)控之王，其研究最早，且分布廣，修飾量最多。在真核細(xì)胞中，約1/3的蛋白隨時都可以被磷酸化，幾乎參與所有的生理、病理過程。因此，磷酸化修飾是所有修飾中最被廣泛認(rèn)知和重點研究的。

▲ 磷酸化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

綜上這些特點，在國自然基金申請中，與磷酸化、激酶相關(guān)的研究歷年所獲的資助項目數(shù)目均較多、且金額較高。然而，其成熟的研究基礎(chǔ)也使得其每年的基金資助趨勢穩(wěn)定平緩。2018年的基金統(tǒng)計結(jié)果表明，與磷酸化相關(guān)的項目數(shù)有105個，資助金額4768萬，而與激酶相關(guān)的項目數(shù)140個，資助金額高達(dá)6414.9萬，其中重點項目有2個。因此，磷酸化可以說是修飾的基金申請中一個表現(xiàn)非常穩(wěn)定的方向。

圖1.國自然基金項目統(tǒng)計-磷酸化

▲ 磷酸化修飾組學(xué)研究方案的技術(shù)注意點：

● 磷酸化修飾肽段富集方法如何選擇？

由于發(fā)生磷酸化修飾的氨基酸有三種--絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，故根據(jù)研究目的的不同，磷酸化修飾肽段的富集方法也不同。目前，比較成熟的磷酸化富集方法主要有：金屬螯合物富集（如TiO2、IMAC富集）和抗體富集兩類。

對于三種氨基酸位點上的修飾均關(guān)注的老師來說，金屬螯合物富集是最常用的富集介質(zhì)。其富集效率較高，通常可以達(dá)到90%以上，其中一些商品化的IMAC試劑盒具備很理想的富集穩(wěn)定性。

而對于重點關(guān)注酪氨酸磷酸化修飾變化的老師來說（比如說不少關(guān)注腫瘤領(lǐng)域中受體酪氨酸激酶研究的方向），使用TiO2、IMAC則無法滿足要求了，這是由于酪氨酸磷酸化的修飾比例非常低，僅占所有蛋白質(zhì)磷酸化比例的1%。因此，針對這類分析，往往采用酪氨酸特異性基序的抗體進(jìn)行富集，才能獲得最佳結(jié)果（中科新生命（APT）采用抗體界的金標(biāo)準(zhǔn)--CST的抗體進(jìn)行酪氨酸磷酸化的富集）。

● 對于后續(xù)結(jié)果驗證或者靶向檢測的研究目的，如果沒有修飾位點的抗體該怎么辦？

基于質(zhì)譜的PRM技術(shù)是修飾組后續(xù)驗證或目標(biāo)位點靶向檢測的最佳選擇之一。PRM驗證全稱是Parallel Reaction Monitoring,其是基于高分辨率質(zhì)譜發(fā)展的靶向定量技術(shù)。由于其只針對特定目標(biāo)信號進(jìn)行掃描，可實現(xiàn)目標(biāo)蛋白、修飾位點的精準(zhǔn)定量，其應(yīng)用目的類似于Western blot。

PRM已逐漸被業(yè)內(nèi)廣泛認(rèn)可和關(guān)注，Nature、PNAS等高水平研究中已有多篇研究應(yīng)用。此外，PRM可同時對多個蛋白、修飾位點進(jìn)行定量，相比傳統(tǒng)的WB,不僅更準(zhǔn)確、精細(xì)而且更高效。目前，中科新生命已推出磷酸化修飾組+PRM驗證一站式服務(wù)，幫助老師快速解決驗證之憂。

● 磷酸化修飾組對樣本量的要求如何？

勢頭正猛：泛素化——蛋白表達(dá)調(diào)控研究的新角度

泛素化是所有修飾中最為特別的一類修飾，由于發(fā)生泛素化修飾的蛋白往往會進(jìn)一步通過蛋白酶體發(fā)生降解（也有一部分會發(fā)揮腳手架的作用促進(jìn)蛋白復(fù)合體形成等），因此，蛋白表達(dá)水平變化往往是泛素化修飾的重要關(guān)注點。泛素化修飾與轉(zhuǎn)錄、蛋白水平研究同樣重要的，都是調(diào)控蛋白表達(dá)水平的重要機制之一，但卻往往被研究人員所忽略，其具備相對較高的研究創(chuàng)新性。

▲ 泛素化修飾在歷年國自然基金中的申請情況

從歷年的基金申請情況看，泛素化修飾所申請項目數(shù)與金額自2013年后每年均呈現(xiàn)快速增長趨勢，而且2017年-2018年的增長速度為歷年最快。統(tǒng)計結(jié)果表明，2018年泛素化研究的資助項目達(dá)137個，資助金額共6680.45萬，其中重點項目有5個。

由此可見，泛素化相關(guān)基金無論是申請項目數(shù)還是金額數(shù)均在向磷酸化逼近，甚至從重點項目數(shù)看，18年泛素化的項目數(shù)已然超過了磷酸化。進(jìn)一步統(tǒng)計表明，泛素化研究資助項目在醫(yī)學(xué)部中一共98項，總資助金額高達(dá)4700萬元。由此可見，泛素化的相關(guān)研究正是科研界的“當(dāng)紅小生”，基金申請的一大熱點。

圖2.國自然基金項目統(tǒng)計-泛素化

除基金之外，近幾年，泛素化更是頻頻出現(xiàn)在各大CNS頂級雜志上，成為CNS雜志綜述討論的熱點話題，從各種生理過程、到腫瘤、衰老等疾病、再到藥物開發(fā)�？梢姡湓卺t(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要作用、巨大潛力越來越得到重視，并有望成為繼磷酸化之后的第二大明星修飾類型。

中科新生命

▲ 泛素化修飾組研究方案的技術(shù)注意點：

● 泛素化修飾肽段富集的選擇？

目前，泛素化修飾肽段的富集還是采用基于賴氨素修飾基序抗體（K-GG）進(jìn)行富集（同樣，中科新生命是采用來自CST公司的抗體進(jìn)行富集）。

● 泛素化修飾組的結(jié)果如何解讀？后續(xù)驗證有什么注意點？

由于泛素化修飾的蛋白很可能涉及后續(xù)的蛋白降解，因此各位老師在拿到泛素化組的數(shù)據(jù)時，如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果中呈現(xiàn)出泛素化修飾的表達(dá)減少，不要認(rèn)為一定是泛素化修飾水平降低了！其既有可能是修飾水平降低了也有可能是修飾水平增加了，這是泛素化修飾與其他修飾的結(jié)果解讀非常不同的地方。因為泛素化修飾增加可直接導(dǎo)致蛋白降解，所以蛋白若是發(fā)生了泛素-蛋白酶體降解，其修飾量也是隨著蛋白降解而降低的。因此，對于進(jìn)行細(xì)胞水平研究的老師而言，我們建議需要用MG132預(yù)先處理細(xì)胞，抑制泛素酶體的降解過程。對于泛素化修飾的后續(xù)驗證，不僅要驗證修飾水平的變化，還要再進(jìn)行蛋白水平的驗證分析。

● 泛素化修飾組對樣本量的要求如何？

推薦：常規(guī)動物組織樣本120mg-2g；常規(guī)植物組織樣本500mg-2g；細(xì)胞樣本1-5×10^8個細(xì)胞

另辟蹊徑：乙酰化修飾----代謝表現(xiàn)背后的調(diào)控機制

相對于磷酸化、泛素化而言，乙�；芯扛鼘﹃P(guān)注于其對組蛋白的表觀調(diào)控，而非組蛋白上的乙�；揎梽t相對較少。尤其是乙酰化對代謝過程的廣泛調(diào)控作用，更是近些年才被認(rèn)知的開創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)。

▲ 乙�；揎椩跉v年國自然基金中的申請情況

從歷年的基金申請情況看，乙�；揎棻憩F(xiàn)絲毫不落后，其相關(guān)研究所申請到的項目數(shù)、金額均呈現(xiàn)逐年增加的趨勢，而且，在近兩年（2016年-2018年）的增加速度最快。2018年，乙�；芯康馁Y助項目有111個，資助金額共5426萬，重點項目2個。其中，醫(yī)學(xué)部的乙�；芯抠Y助項目占48項，共3800萬元資助。

圖3.國自然基金項目統(tǒng)計-乙�；�

實際上，乙酰化的研究已有50年，除了發(fā)生于組蛋白，還有有大量的乙�；揎椀鞍状嬖谟诩�(xì)胞漿、線粒體等中，其對于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬等生物功能有廣泛的調(diào)控作用。2009年，SCIENCE同時發(fā)表兩篇研究，把乙�；芯繋氲揭粋€新高度。其中一篇SCIENCE報道，在肝臟中發(fā)現(xiàn)了超過1000個乙�；鞍踪|(zhì)，且代謝酶上普遍發(fā)生這樣的修飾，至此，乙�；{(diào)控代謝成為了編入教科書級的發(fā)現(xiàn)，代謝表型背后的調(diào)控機制--乙酰化，成為了代謝調(diào)控研究的新領(lǐng)域。這幾年的nature reviews上，也是頻頻刊登“乙酰化調(diào)控代謝”的熱點綜述。

nature reviews

從組學(xué)的研究來看，乙�；{(diào)控代謝是從一個非常具有新穎性的切入角度，這個角度使得對乙�；δ艿奶剿鞑粌H僅局限于組蛋白上。因此，修飾組配合代謝組進(jìn)行研究，是打通機制與表型的研究策略，是一個更為完整、創(chuàng)新的國自然基金研究方案。

▲ 乙酰化修飾組研究方案的技術(shù)注意點：

● 乙�；揎楇亩胃患绾芜x擇？對樣本量要求如何？

乙酰化修飾肽段富集主要采用賴氨酸乙�；蚩贵w進(jìn)行富集（同樣，中科新生命使用CST公司的修飾抗體）。

● 若要進(jìn)行乙�；M+代謝組的聯(lián)合分析，對樣本有何要求？

對于聯(lián)合而言，保證兩個組學(xué)樣本間的一致性是關(guān)鍵。因此，乙�；c代謝聯(lián)合，我們推薦兩個組學(xué)的樣本來源均一致。如果有老師想要進(jìn)一步利用相關(guān)性分析進(jìn)行深入數(shù)據(jù)挖掘，兩個組學(xué)之間的樣本重復(fù)數(shù)目也要保持一致。

● 乙酰化修飾組對樣本量的要求如何？

推薦：常規(guī)動物組織樣本120mg-2g；常規(guī)植物組織樣本500mg-2g；細(xì)胞樣本1-5×10^8個細(xì)胞

總結(jié)

縱觀歷年國自然申請情況，修飾都是申請中重大研究方向之一。到2018年國自然，磷酸化、泛素化、乙酰化，每一類修飾類型的項目資助金額均超過5000萬，修飾方向的總研究資助金額超2億。

如今，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜作為研究翻譯后修飾的最重要技術(shù)之一，越來越被廣泛的應(yīng)用于修飾的研究之中，也越來越能夠與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)契合，助力高層次的研究。