產(chǎn)品說明書

本產(chǎn)品僅限用于研究，嚴禁用于疾病診斷。

本產(chǎn)品僅供購買方內(nèi)部研究使用，未經(jīng)維真生物公司書面許可，嚴禁轉(zhuǎn)售。

產(chǎn)品有限責任擔保

維真生物保證您收到的產(chǎn)品符合產(chǎn)品目錄上的規(guī)格。本擔保規(guī)定了維真生物更換產(chǎn)品的責任。維真生物不提供其他任何形式的對于產(chǎn)品商業(yè)或健康用途的保證。維真生物不對任何由于使用或不正確使用本公司產(chǎn)品造成的直接、間接的、衍生的或偶然的損害所產(chǎn)生的后果負責。

腺相關(guān)病毒安全操作規(guī)范

1. 請在BL2生物安全二級生物安全柜中操作病毒。

2. 操作病毒和轉(zhuǎn)染細胞時，請務(wù)必穿著實驗服，佩戴口罩和手套。

3. 請小心操作，避免產(chǎn)生氣霧或飛濺。被病毒污染的超凈工作臺，請立即用70%乙醇加1% SDS溶液擦拭干凈。接觸病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請使用新鮮配制的10％漂白粉進行消毒操作后丟棄。

4. 用顯微鏡觀察細胞感染情況時，請先擰緊培養(yǎng)瓶或蓋緊培養(yǎng)板，用70%乙醇擦拭培養(yǎng)瓶外壁后，顯微鏡下觀察拍照。觀察完畢，請用70%乙醇再次擦拭顯微鏡實驗臺。

5. 離心病毒時，應(yīng)使用密封性好的離心管，或用封口膜封口后進行離心，請盡量使用組織培養(yǎng)室內(nèi)的離心機。

6. 實驗完畢脫掉手套后，請立即用肥皂和水清洗雙手。

個人保護措施

1. 使用一次性手套。

2. 在注射病毒或是其后的解剖時，使用一次性手術(shù)服或是相當?shù)囊挛�，如果是感染細胞時，可以穿著實驗服。

3. 佩戴護目鏡或是面罩。

4. 所有的操作應(yīng)當是在 Class II 生物安全柜中進行。如果實驗條件不能滿足，則應(yīng)當在空氣穩(wěn)定的空間中操作，減少操作時間和病毒與外界接觸的時間。

不慎接觸病毒時的急救

1. 病毒飛濺或是氣溶膠與人體接觸–眼，皮膚或是粘膜用大量清水沖洗眼睛或是其他接觸的部位至少15 分鐘。

2. 含病毒的針頭或是其他利器刺破皮膚。傷口立即用10%的碘伏溶液擦洗數(shù)分鐘，然后用大量清水沖洗。

消毒處理

對AAV 有效的消毒劑是新鮮配制的1%次氯酸鈉溶液。

♦ 配制時，將84 消毒液原液加水稀釋。

♦ 浸泡15min 以達到消毒目的。

♦ 可以用它處理可回收的物品如玻璃器皿或是污染廢液（終濃度是1%），但如果是不銹鋼器物切不可直接擦拭，否則會引起表面腐蝕。

其他的處理方式包括用2%戊二醛溶液或是0.25% SDS 溶液，還可以121℃高溫消毒1小時。

腺相關(guān)病毒的保存

收到產(chǎn)品后，請根據(jù)實驗所需的量在無菌操作臺中將病毒進行分裝，并于-80 ℃冰箱凍存。分裝病毒時請將病毒始終放置在冰上。

注：請避免反復(fù)凍融。

AAV載體概述

腺相關(guān)病毒(AAV)是一種無包膜的單鏈DNA病毒，是細小病毒家族的一員，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能進行自我復(fù)制。在沒有輔助病毒的情況下，

AAV可在哺乳動物細胞中長期潛伏。現(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的 AAV 有 12 種的血清型（AAV1 至 AAV12）和 130多種突變型[1] 。不同AAV血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列和組織特異性，因而其識別與結(jié)合的細胞表面受體也相應(yīng)有很大差別[2]，這也導致不同血清型轉(zhuǎn)染的細胞類型和感染效率也各不相同。在基因治療中，將攜帶有外源基因的重組腺相關(guān)病毒定點整合到宿主基因組，既能克服隨機插入所導致的染色體缺失和基因重排等潛在危險，又可以達到長期治療的目的。

野生型AAV基因組編碼兩大開放閱讀框架(open reading frames，ORF) rep和cap，它們位于兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(interted teminal repeats，ITRs)之間。在 Vigenebio的AAV 病毒基因傳遞系統(tǒng)中，只有ITRs是復(fù)制和包裝所必需的順式元件，rep和cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒AAV rep/cap Vector中，轉(zhuǎn)移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的最大限度。在輔助質(zhì)粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector的幫助下，僅需兩端的 ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進入腺相關(guān)病毒顆粒。

重組腺相關(guān)病毒是基因傳遞和表達的一個重要工具[3]，其具有廣泛的宿主范圍及組織感染能力，既能感染分裂細胞，也能轉(zhuǎn)導外源基因進入非分裂細胞，長期表達外源基因，而不依賴于宿主細胞活躍的分裂能力。在Vigenebio公司的AAV病毒基因傳遞系統(tǒng)中，包含末端重復(fù)序列(ITRs)的載體質(zhì)粒pAV-FH AAV 載體與包含rep/cap 基因的輔助質(zhì)粒pAAV-rep/cap載體沒有任何共同區(qū)域，避免通過重組而恢復(fù)出野生型病毒，宿主細胞免疫反應(yīng)被降至最低，從而允許對具有免疫能力的宿主細胞進行基因傳遞。我們的AAV病毒基因傳遞系統(tǒng)可以生產(chǎn)出重組病毒滴度≥1011 病毒顆粒/毫升的病毒，濃縮后滴度最高可達1014 病毒顆粒/毫升，可以最大程度保證在動物細胞中的基因傳遞。rAAV進入細胞后，作為附加的DNA能穩(wěn)定存在。基因的表達通常在第2〜7天出現(xiàn)峰值，并可在體內(nèi)持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月。

腺相關(guān)病毒基因傳遞和表達的優(yōu)勢

1.宿主范圍廣：隨時可轉(zhuǎn)染的AAV可高效感染分裂和非分裂細胞；

2.多種血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和AAV9等；

3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分別由獨立的質(zhì)粒表達；未發(fā)現(xiàn)AAV對人體致病，rAAV去除了wtAAV基因組的96%，進一步保證了安全性；

4.免疫原性低：AAV2 的基因組僅 4681 個核苷酸，便于用常規(guī)的重組 DNA技術(shù)進行操作，而且進行動物實驗時造成的免疫反應(yīng)小；

維真腺相關(guān)病毒的優(yōu)勢

1）載體全：不同的啟動子（神經(jīng)特異性啟動子Human Synapsin、CamkIIα、GFAP等）和多種報告基因（EGFP、mCherry、RFP和luciferase等）可供客戶選擇；

2) 貨期短：AAV克隆載體均與我們18,000個預(yù)制人類全長cDNA ORF克隆載體MCS區(qū)通用，行業(yè)中的生產(chǎn)周期短；

3）滴度高：可提供 1012V.G/ml及以上滴度的病毒.，最高可達1014V.G/ml；

4）服務(wù)優(yōu)：可根據(jù)客戶的具體需求提供特殊定制服務(wù)。

維真 rAAV產(chǎn)品簡介

維真獨有的專利技術(shù)和創(chuàng)新性的rAAV載體和完善的AAV 表達系統(tǒng)，可用于體內(nèi)和體外表達shRNA，human ORF和CRISPR，具有穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、純度高、滴度高的優(yōu)點。

AAV無輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System）可以在無輔助病毒的條件下生產(chǎn)出重組人腺相關(guān)病毒。這種系統(tǒng)利用已經(jīng)明確與調(diào)節(jié)AAV 復(fù)制和表達的腺病毒基因產(chǎn)物，并且將這些基因產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)染引進宿主細胞。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個質(zhì)粒（Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、Rep/Cap質(zhì)粒）組成。生產(chǎn)具感染性的AAV 病毒顆粒所需的腺病毒基因產(chǎn)物（例如：E2A,E4 和VA RNA 基因）大部分由與其他質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進細胞的pHelper 質(zhì)粒提供，其余的腺病毒基因產(chǎn)物由穩(wěn)定表達腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主細胞提供。Rep 和Cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒載體中，實際上在輔助質(zhì)粒的幫助下，僅需兩端的ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進入腺相關(guān)病毒顆粒，Rep 和Cap 基因的轉(zhuǎn)移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的最大限度。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與Rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。Vigenebio的腺相關(guān)病毒載體ITR序列Rep/Cap基因分別由獨立的質(zhì)粒表達,具有高度安全性。圖1為rAAV進入細胞和轉(zhuǎn)運的過程。

 

2.2 rAAV shRNA克隆服務(wù)

 

維真為您提供了多種表達shRNA的rAAV，包括U6或H1啟動子和作為哺乳動物表達標記的GFP或RFP。同時，也可根據(jù)您感興趣的基因提供shRNA設(shè)計服務(wù)。

2.3 rAAV載體容量

腺相關(guān)病毒載體能夠感染分裂和非分裂細胞。毒性和免疫原性低，適合以相對較高的轉(zhuǎn)染效率在非分裂細胞中長期表達和在分裂細胞中短期表達基因。但AAV載體的外源基因容納量有限，兩個ITR之間的空間只有4.9kb，因此可插入的外源基因為3.5kb甚至更小。請參閱本表選擇適合您的病毒載體系統(tǒng)。

腺相關(guān)病毒顆粒生產(chǎn)流程

第一步：基因克隆。將外源基因克隆進入維真生物公司的人源或shRNA腺相關(guān)病毒載體，pAV-FH AAV等載體的多克隆位點與我們的human ORF穿梭克隆相兼容，非常適于哺乳動物ORF的表達。

第二步：細胞轉(zhuǎn)染。將攜帶外源基因的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒Ad Helper Vector和pAAV-rep/cap Vector共轉(zhuǎn)染進入HEK293T細胞，感染72h之后即包裝完畢。

第三步：收毒。分別收獲培養(yǎng)基上清與細胞沉淀，PEG8000沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，培養(yǎng)基上清先用0.45um濾膜過濾。

第四步：病毒純化。通過碘克沙醇法對病毒進行純化，一方面提高病毒滴度，另一方面某些動物實驗需要純化之后才可進行。

第五步：滴度檢測。用QPCR的方法來檢測病毒的滴度，得到的結(jié)果為包裝得到的病毒顆粒數(shù)。

維真生物的pAV-FH AAV載體，具有Amp抗性、CMV啟動子，帶有Flag-His標簽。多克隆位點與維真的human ORF穿梭克隆相兼容。非常適于哺乳動物ORF的表達。維真生物為您提供了多種表達shRNA的rAAV，包括U6或H1啟動子和作為哺乳動物表達標記的GFP或RFP。同時，也可根據(jù)您感興趣的基因提供shRNA設(shè)計服務(wù)。

pAAV-rep/cap質(zhì)粒（圖）包含AAV編碼復(fù)制蛋白和病毒衣殼蛋白的rep和cap基因，獲得期望的高滴度病毒產(chǎn)品的關(guān)鍵基因。

pHelper 質(zhì)粒（圖）包含AAV-HEK293T 生產(chǎn)高滴度病毒必須的的腺病毒基因VA，E2A 和E4 的集合。提供AAV 生產(chǎn)所必需的腺病毒蛋白質(zhì)E1A 和E1B 在HEK293T 細胞中穩(wěn)定表達。

1.腺相關(guān)病毒重組克隆構(gòu)建

1）根據(jù)訂單不同選擇不同的載體，在此以人源基因克隆為例。

2）維真生物公司的AAV載體與我們的人源ORF庫中的穿梭質(zhì)粒的多克隆位點相兼容，通過酶切，連接，轉(zhuǎn)化的方式將基因亞克隆進入pAV-FH AAV載體，得到陽性克隆之后進行酶切跑膠驗證及測序以確認插曲片段的正確性。

2.細胞凍存流程

1)按照培養(yǎng)細胞流程，將細胞吹下來加入50ml離心管中， 800g離心5min。

2)配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。

3)離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細胞吹勻

4)取上述溶液1ml分至1.5ml細胞凍存管中，做好標記和日期。

5)放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80度冰箱過夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室溫，使異丙醇的溫度達到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線上）。

6)第二天將凍存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

3.細胞復(fù)蘇流程

1)10cm培養(yǎng)盤中加10cm新鮮DMEM培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱預(yù)熱至37℃。

2)從液氮中取出冷凍管，迅速投入37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1-2分鐘左右）。

3)待細胞凍存管中溶液尚未完全融化時加入預(yù)熱的培養(yǎng)盤中。

4)搖晃均勻，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

5)4h后待細胞完全貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基（除去凍存液中DMSO對細胞的毒害作用。也可在第3步中800g離心5min，除去培養(yǎng)基后再懸浮細胞添加至新鮮預(yù)熱的DMEM細胞培養(yǎng)皿中）。

4.細胞培養(yǎng)流程（以10cm細胞培養(yǎng)皿，傳代為例）

1)生物安全柜紫外滅菌半小時。

2)滅菌期間，DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，1%青鏈霉素混合液)、PBS以及0.25%胰酶在37℃水浴鍋中預(yù)熱。

3)取匯合度接近100%活性好的的HEK293T細胞，吸棄培養(yǎng)盤中培養(yǎng)基，加約5ml，1 ×PBS，搖晃幾下，吸棄PBS。（加PBS目的主要除去殘留在皿中的培養(yǎng)基中的FBS，以提高胰酶的消化效率）

4)加1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜內(nèi)消化約1min，室溫低時可放置于培養(yǎng)箱中消化。消化時間不宜過長，否則影響細胞再次貼壁效率和活性。

5)加入約5ml的預(yù)熱的培養(yǎng)基。

6)用移液管吹打均勻，按照1:3比例傳代。各洗2ml培養(yǎng)基至新的10cm皿中，再加入8ml預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基。（吹打過程中不可用力過大，否則會吹破細胞）。

注意：傳代盤數(shù)較多時，要先將預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基加入到10cm皿中，再加入含細胞的培養(yǎng)基，以避免細胞分布不均。放置于培養(yǎng)箱前輕輕混勻皿中的培養(yǎng)基，使細胞均勻分散于培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)條件為5%-7%CO2濃度，37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)無菌水盤內(nèi)水份提供一定的濕度。

細胞傳盤以及分6孔板，24孔板，96孔板分細胞都經(jīng)過上述流程，只是細胞數(shù)與分的比例不同，具體情況具體操作。

 

5.AAV 病毒包裝

以10cm細胞培養(yǎng)皿為例

第一天: 聚合度90%以上的HEK293T細胞按1：3比例傳盤（每盤大約2.5 x 106），培養(yǎng)基Hyclone高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%FBS）。

第二天: 轉(zhuǎn)質(zhì)粒前1-2h左右，換成無血清培養(yǎng)基（所有血清型AAV），用轉(zhuǎn)染試劑將目的基因質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（需用酚氯仿提取的質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入HEK293T中。

第三天：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化24h后，換新的無血清培養(yǎng)基（所有血清型AAV）

第五天：轉(zhuǎn)染72h收毒。帶著培養(yǎng)基，吹下細胞，離心；然后分別收獲培養(yǎng)基上清與細胞沉淀。用PEG8000沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，沉淀過夜后收集病毒沉淀。

6.AAV病毒純化

1)收集病毒沉淀和細胞沉淀。

2)細胞沉淀-80℃保存，后續(xù)實驗用。

3)破碎細胞。

4) 將病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度離心進行純化。

7.病毒濃縮

用超濾管進行濃縮。

8.病毒滴度檢驗

1)腺性相關(guān)病毒處理破除AAV病毒外殼 ，37 ℃ 孵育30 min，然后加熱 95 ℃5 min 使酶失活，體系如下：

組成成分

體積

病毒液

5ul

蛋白酶K（5ug/ul）

1ul

超純水

4ul

2)離心12000rpm,2min.取上清。

3)標準品的拷貝數(shù)，7個梯度稀釋濃度分別：7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V.G./UL,7.2E+2V.G./UL.并將超純水作為陰性對照。

4)配制PCR反應(yīng)體系，每個樣品20 ul體系，體系如下：

組成成分

體積

2X SYBRGreen緩沖液

10ul

F、R引物混合物

0.8ul

超純水

7.2ul

病毒樣品或標準品

2ul

5)PCR反應(yīng)體系

組成成分

體積

95℃

5min；

95℃

15sec

60℃

15sec

72℃

15sec

40個cycles

6)病毒顆粒數(shù)公式：病毒顆粒數(shù)（個/ml）= 與標準品相對值 × 1000

腺相關(guān)病毒感染目的細胞預(yù)實驗

以2型AAV病毒為例，維真生物為您推薦的MOI值10000:1-100000:1，是根HEK293T細胞得出的數(shù)據(jù)，不同的細胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議您感染目的細胞前，進行預(yù)實驗摸索最佳MOI值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。

1. 為了節(jié)省病毒，推薦使用96孔板進行預(yù)實驗。

2. 將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保證細胞貼壁過夜。

3. 取10ul AAV病毒原液加入90 ul培養(yǎng)基中做1:100稀釋（10-2），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7�？筛鶕�(jù)實際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

4. 取出提前準備好的96孔板，先確定細胞生長狀況是否良好。用準備好的病毒稀釋液替代舊培養(yǎng)基，注意保留未加入病毒的細胞孔作為對照組。

5. 在加入病毒稀釋液后，請在12-24h后觀察細胞狀態(tài)來確認加入的病毒量是否合適，是否因為加入的病毒量影響細胞狀態(tài)。如果細胞沒有變化，即所加病毒對細胞沒有毒性，可以繼續(xù)培養(yǎng)。

6. AAV病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后每天觀察細胞中熒光表達情況。 (成功案例: 山大醫(yī)院學生

 

 

利用我司提供的AAV病毒感染jurkat，ca46細胞,在MOI值105時,

一個星期后看到熒光表達,并且成功通過WB檢測到目的基因的表達)（如果您選擇的產(chǎn)品帶有GFP標簽，如果沒有熒光標簽請選擇在96小時以后的不同時間段分別收獲細胞并通過Western-Blot或其他檢測手段來檢測基因表達）。

注：由于AAV組織特異性，體外感染細胞的效率比較低，所以我們強烈推薦您購買AAV用于動物實驗。

AAV使用情況實例分析

1.AAV感染不同種類的細胞

HEK293T

 

 

AAV雖然也可體外感染一些細胞，但感染效率比較低。具體感染效率可以參考本手冊的常見問題解答中的附表。

2.AAV感染神經(jīng)干細胞

 

Sorted cells were expanded for an additional26 days (total 40 days after AAV infection), and ~94.5% of cells maintained GFP and nestin expression

Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(4): 667-675.

由于AAV的低免疫原性，即便感染干細胞，也不會引起細胞的分化。

3.各種類型的重組AAV注射入不同神經(jīng)發(fā)育階段的小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生不同分布

 

Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680.

注射方法：腦室注射

注射劑量：2×1010 v.p

4.不同血清型的AAV感染心臟心肌細胞

 

由于組織特異性，即便提高病毒的注射量，對于低表達的血清型，其所攜帶基因的表達水平?jīng)]有太大的改善。由圖可知，AAV9型對心肌細胞的感染效率極高，AAV8次之。

5.重組AAV1-SERCA2a轉(zhuǎn)導入豬冠狀動脈的表達

 

Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

注射方法：冠狀動脈注射

注射劑量：1012v.p

6. AAV1特異性感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及不同類型AAV感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的效果

 

Edmund R Hollis II， Ken Kadoya， Matthew Hirsch， Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski ，Molecular Therapy , vol16 ,no. 2, feb, 2008.

注射方法：神經(jīng)肌肉注射

注射劑量：2.1x10E8 v.p

分別用AAV1-6感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，AAV1的效果好，感染運動神經(jīng)元的數(shù)目最多。

7.不同血清型AAV 體外注射大鼠5天后在腦的海馬回中的表達

 

Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006, 3 , 13(3).

8.AAV2在研究小鼠脈絡(luò)膜新生血管形成中作為基因?qū)�入的載體

 

Therapeutic effect of CBAPEDF-AAV2 on choroidal neovascularization development and antibody responses to AAV2 capsid following single and sequential intravitreal injections.A-D:Representative CNV images from mouse eyes that were untreated (A), received a single intravitreal (IV) treatment (B), received first IV treatment (C), and received a second IV treatment (D) of AAV2-PEDF.

Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769.

注射方法：玻璃體腔內(nèi)注射

注射劑量：4x10E10 V.G.

9.AAV7,8感染視錐形細胞

 

 

注射方法：在接近晶狀體的虹膜上切開一個小口后，緩慢（20-30秒內(nèi)）注射。至少在3個星期后進行后續(xù)的實驗。

注射劑量：2ul。

10. scAAV9 介導的CB-GFP標記靜脈注射入大鼠3周后在腦的星形膠質(zhì)和神經(jīng)元中表

 

a:紋狀體; b:海馬回；c:齒狀回；d :小腦浦肯野細胞; e:海馬回的椎體細胞f:齒狀回的顆粒細胞；a-d 新生鼠 e-f成年鼠（f）200 mm (e); 100 mm (f),50 mm (a–d)Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射

注射劑量：4 × 1011v.p

11.AAV8感染肝臟肝細胞

 

注射方法：尾部靜脈注射

注射體積：200ul、1012v.p

12. AAV9 介導的標記注射成年小鼠7周后在脊髓和大腦的表達

 

a-d:頸椎，e-h:腰椎，i-l:星形膠質(zhì)細胞，m-p:腦

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult

astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射

注射劑量：4 × 1012v.p

13. AdVLacZ, AAV2LacZ, 和 AAV8LacZ 介導的標記在C57Bl/6鼠的胰腺中的表達

AdVLacZ AAV2LacZ AAV8LacZ

 

胰腺胰島細胞

Wang A Y, et al. Comparison of adenoviral and adeno-associated viral vectors for pancreatic gene delivery in vivo[J]. Human gene therapy, 2004, 15(4): 405-413.

注射方式：胰腺注射

注射劑量： AdVLacZ-108pfu；AAV2，8LacZ-1011v.p

AAV比腺病毒的持續(xù)表達時間要長很多，通常AAV可在體內(nèi)表達數(shù)周甚至數(shù)月，但是腺病毒僅能表達幾天。

14. AAV-1-6，8 和慢病毒介導的GFP在大鼠的脊髓中的表達

 

Blits B, Derks S, Twisk J, et al.Journal of neuroscience methods, 2010, 185(2): 257-263.

注射方法：脊髓注射

注射劑量：注射5×108v.p不同外殼的AAV 病毒

由圖顯示，AAV介導的在大鼠脊髓中的基因表達要比慢病毒介導的表達更高。AAV比慢病毒更容易轉(zhuǎn)染脊髓。

常見問題解答

1.什么是Adeno-associated virus (AAV) &重組AAV(rAAV) & helper free rAAV?

腺相關(guān)病毒（AAV）屬于微小病毒科，是一類小的、二十面體、無包膜病毒。AAV是一種復(fù)制缺陷病毒，復(fù)制依賴于其他輔助病毒，如腺病毒和皰疹病毒。AAV不編碼自己的聚合酶，因此其復(fù)制過程依賴于宿主細胞的聚合酶活性。

重組AAV（rAAV）是人工改造的AAV，沒有編碼AAV病毒復(fù)制和結(jié)構(gòu)蛋白的rep和cap基因。rAAV中與復(fù)制和包裝相關(guān)的rep和cap 基因被替換為ITRs間的基因或結(jié)構(gòu)，這使rAAV具有4.1-4.9 kb的包裝容量。

2.使用AAV有哪些生物安全性要求?

可在生物安全1級（BSL-1）實驗室操作生產(chǎn)無輔助病毒和編碼非致癌基因的重組AAV。另外，應(yīng)在生物安全2級（BSL-2）實驗室封閉處理具有生物危害性的材料。

3.重組AAV 安全嗎?

迄今為止，未發(fā)現(xiàn)野生型AAV有致病性。野生型AAV，在無需輔助病毒（如腺病毒）的存在下，復(fù)制效率非常低。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個質(zhì)粒（cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒、rep/Cap質(zhì)粒）組成。Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有復(fù)制的能力。

4.重組AAVs的克隆容量有多大?

AAV具有〜4.7Kb的包裝能力。2個ITR之間插入的DNA長度接近允許的最大值4.7Kb時，包裝效率顯著降低。例如，對于過表達來自cDNA的基因，CMV-poly（A）信號元件約為1KB，因此最大可包裝的cDNA長度約為3.2kb，如果共表達GFP（約0.8kb），則可包裝的容量大約為2.4kb。

5.哪些血清型的 AAV 可供選擇？我該選用哪種AAV呢?

目前為您提供的AAV 血清型為AAV1，AAV2，AAV5，AAV7，AAV6，AAV8 & AAV9。請參閱下面指南中參考文獻的建議。

 

 

請同時參閱轉(zhuǎn)染效率與不同細胞類型對照表，以確定哪種血清型AAV更適合您的細胞。

6.使用重組腺相關(guān)病毒rAAV傳遞基因的優(yōu)勢是什么?

rAAV病毒滴度很高，可感染分裂和非分裂細胞、免疫原性極小、體內(nèi)表達外源基因時間長。

7.AAV 載體穩(wěn)定嗎? 如何保存AAV載體 ?

純化的AAV載體在4℃或更低溫度下高度穩(wěn)定。建議您將AAV分裝后，-80℃下長期保存。

8.訂制AAV服務(wù)，客戶需要提供哪些材料? &客戶收到的產(chǎn)品是怎樣的?

您可以從我們的人源全長cDNA庫(17,000預(yù)制ORF)中挑選，或者提供您的質(zhì)粒DNA或DNA序列，我們將基因克隆至AAV載體。您還可以指定特定的融合標簽和AAV血清型。

基因沉默服務(wù)，請您提供確切的shRNA的序列以構(gòu)建重組rAAV載體。我們的標準載體具有U6啟動子和GFP標記。

通常情況下，可為客戶提供500 ul病毒液1×10^12 V.G. /ml。也可根據(jù)客戶的需要，提供特定體積和滴度的產(chǎn)品。