追蹤真菌的生長和生物膜的形成在食品和制藥行業(yè)有著重大意義：了解真菌生長的模式和機(jī)制，可以幫助我們更有效地利用有益真菌、遏制有害菌。真菌在不同發(fā)育時(shí)期的生長情況依賴于胞內(nèi)活動和所處的生化環(huán)境。但是目前常用的共聚焦顯微鏡和電鏡技術(shù)并不能完美地完成這個(gè)任務(wù)。

發(fā)表于ChemPhysChem的《Exploring Morphological and Biochemical Linkages in Fungal Growth with Label-Free Light Sheet Microscopy and Raman Spectroscopy》采用Leica光片技術(shù)DLS，直接利用真菌本身的自發(fā)熒光：由于代謝狀態(tài)不同，這個(gè)自發(fā)熒光“特異性標(biāo)記”在孢子上，而菌絲基本沒有。從圖可以看到利用DLS，明顯看到孢子的分布規(guī)律：朝向頂端，呈梯度分布，離頂端越近孢子密度越大。成像深度達(dá)1.1mm，完全滿足對完整真菌的研究。這個(gè)梯度分布表明真菌存在內(nèi)部的生長調(diào)節(jié)機(jī)制。再結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-Enhanced Raman Spectroscopy ( SERS)），將復(fù)雜的物理化學(xué)作用與真菌生長的形態(tài)學(xué)特征直接關(guān)聯(lián)起來，為次級代謝產(chǎn)物與真菌生長關(guān)系的研究提供了一個(gè)很好的工具。

我們先來看看什么是光片顯微技術(shù)【2】：

使用一層光束從樣品側(cè)面激發(fā)熒光樣品，使用CCD或sCMOS進(jìn)行檢測，照明光路和熒光檢測光路互相垂直。由于樣品受激發(fā)的平面就是成像平面，不存在離焦激發(fā)，可以自動獲得光學(xué)切片，從而將光漂白和光學(xué)損傷降到最低。光片顯微系統(tǒng)使用CCD或sCMOS成像，速度通常為每秒幾十幀，甚至上百幀，所以通過在光片下移動樣品使入射光束激發(fā)不同的平面，可以很容易又非�？焖俚牡玫秸麄�(gè)組織的3D圖。

那我們也會發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的光片顯微鏡通常需要在獨(dú)立系統(tǒng)中安裝專用的光學(xué)裝置，其中照明和檢測物鏡相互垂直布置�？墒窃趯�(shí)際應(yīng)用中很多時(shí)候我們既需要光片又需要共聚焦功能。

Leica TCS SP8 DLS創(chuàng)造性地將光片成像和共聚焦成像結(jié)合在一起：光片直接搭建在共聚焦平臺上，獨(dú)特的 TwinFlect 反光鏡裝置使激發(fā)光束從左右兩個(gè)方向入射到樣品上，照明均勻，且天然的雙側(cè)照明消除昏暗區(qū)域干擾保證了細(xì)胞水平的分辨率。成像速度快、分辨率高和光毒性低的特點(diǎn)可使樣品在該系統(tǒng)中保持其生物活性，完成數(shù)小時(shí)乃至數(shù)天的長時(shí)間活體生物培養(yǎng)及成像。

光片顯微鏡變得前所未有的簡便，同時(shí)又不犧牲共聚焦功能，還可以實(shí)現(xiàn)光片與共聚焦顯微鏡的聯(lián)合使用，完成光激活、光轉(zhuǎn)換等操作及后續(xù)追蹤的實(shí)驗(yàn)。