組織鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

組織鈣離子濃度比色法定量檢測試劑是一種旨在通過鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下與鈣離子反應(yīng)產(chǎn)生紫藍(lán)色復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化，即采用比色法來測定樣品中總鈣離子濃度的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種組織（動物、人體等）裂解萃取樣品中總鈣離子的濃度檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，檢測敏感。

技術(shù)背景

鈣是人體中的一種重要電介質(zhì)和礦物質(zhì)，占1150克。其中99％的鈣以氟磷灰石鈣（calcium fluorophosphate apatite）形式存在于骨組織中。非骨組織鈣成分主要存在于細(xì)胞內(nèi)。鈣具有兩種主要形式：一種是非彌散型蛋白結(jié)合鈣，其構(gòu)成約40％至50％的血清中的總鈣含量；另一種為彌散型游離鈣，其進(jìn)一步分成具有活性的復(fù)合鈣（complexed calcium）和離子鈣（ionized calcium）。鈣對神經(jīng)肌肉興奮性（neuromuscular excitability）、血液凝固、酶的激活、離子跨膜運(yùn)輸、釋放神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)、信使傳導(dǎo)等方面起著重要作用。鈣的檢測包括沉淀法、EDTA鰲合滴定法、火焰光度法（flame photometry）、原子吸收分光光度法等技術(shù)，但容易受到鈉、鉀、磷酸鹽、硫酸鹽的干擾，或者受限于儀器的特殊的要求。鄰甲酚酞絡(luò)合酮（o-cresolphthalein complexone；CPC）比色法是一種穩(wěn)定、簡便、準(zhǔn)確的鈣檢測技術(shù)。鈣與鄰甲酚酞絡(luò)合酮，在堿性條件下反應(yīng)產(chǎn)生紫藍(lán)色復(fù)合物，在分光光度儀下通過吸光峰值的變化（波長570nm），來定量測定組織鈣的總濃度。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

OH^-

  Ca^＋＋  +  o-cresolphthalein complexone   →    violet complex dye

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）      60毫升

裂解液（Reagent B） 10毫升

緩沖液（Reagent C） 20毫升

反應(yīng)液（Reagent D）     2.5毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）     500微升

產(chǎn)品說明書     1份

保存方式

保存在4℃冰箱里；緩沖液（Reagent C）、反應(yīng)液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)樣品配制和樣品保存的容器

微型臺式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿：用于反應(yīng)的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

• 樣品準(zhǔn)備

• 手術(shù)取出動物組織，并秤重以確定組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入適量的（500毫克組織需要3毫升）清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入預(yù)冷的500微升裂解液（Reagent B） 
• 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 強(qiáng)力渦旋震蕩30秒，充分混勻
• 置于冰槽里孵育30分鐘，期間每10分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩30秒（注意：如需暫時(shí)停止，放進(jìn)－70℃冰箱里儲存?zhèn)溆?/EM>）
• 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作