動(dòng)物細(xì)胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版）

主要用途

動(dòng)物細(xì)胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑是一種旨在從動(dòng)物細(xì)胞中分離出完整而純化的線粒體細(xì)胞器，并在蛋白酶抑制混合劑的幫助下，使已純化的線粒體膜結(jié)構(gòu)破裂而獲得線粒體內(nèi)活性蛋白酶系統(tǒng)的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種動(dòng)物細(xì)胞（動(dòng)物和人體的原代細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等）中線粒體總蛋白的制備。可以被用于細(xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、古生物、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。可直接用于特定蛋白后續(xù)純化、蛋白一維或二維電泳、西方雜交、免疫抗體和質(zhì)譜分析等等。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。

技術(shù)背景

線粒體是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，其主要功能是提供細(xì)胞內(nèi)各種物質(zhì)代謝所需要的能量。線粒體中含有豐富的細(xì)胞色素氧化酶系統(tǒng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白等。通過機(jī)械或化學(xué)方法破裂細(xì)胞，進(jìn)而差速離心獲得線粒體，然后通過特殊裂解液和蛋白酶抑制混合劑防止裂解后線粒體內(nèi)各種活性蛋白成分遭到活化的內(nèi)源性蛋白酶的破壞，充分保留線粒體內(nèi)蛋白質(zhì)的免疫和生物學(xué)活性，最后進(jìn)行相關(guān)蛋白的獨(dú)立分析。

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）   100毫升

裂解液（Reagent B）    80毫升

凈化液（Reagent C）    20毫升

強(qiáng)化液（Reagent D）    10毫升

保存液（Reagent E）   160毫升

破膜液（Reagent F）         2毫升

活性液（Reagent G）    20微升

上樣液（Reagent H）     3毫升

產(chǎn)品說明書          1份

保存方式

保存凈化液（Reagent C）和活性液（Reagent G）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里，有效保證6月

用戶自備

HANK平衡鹽緩沖溶液（12028）或PBS緩沖溶液（12033）：用于清理細(xì)胞

胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液（12024）：用于細(xì)胞脫離

完全細(xì)胞培養(yǎng)液（12052）：用于細(xì)胞處理所需的培養(yǎng)基

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

50毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

1.5毫升離心管：用于樣品操作和保存的容器

4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

微型4℃臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

DOUNCE勻漿器：用于裂解細(xì)胞

渦旋震蕩儀：用于混勻

實(shí)驗(yàn)步驟

方法一：物理法

實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒里的凈化液（Reagent C）凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 分別小心抽去緩沖溶液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2至3一次
• 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻細(xì)胞顆粒群
• 即刻放進(jìn)預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用勻漿棒勻化細(xì)胞（約80下）（注意：參見注意事項(xiàng)8）
• 將所有細(xì)胞勻漿物移入15毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆�！���此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進(jìn)行下列操作：

操作一、線粒體總蛋白定量檢測(cè)

1） 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管

2） 加入20微升上樣液（Reagent H）

• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）
• 煮沸5分鐘
• 上樣，進(jìn)行電泳操作和西方雜交

方法二：化學(xué)法

實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的凈化液（Reagent C）取出凍融，然后移出1毫升凈化液（Reagent C）和4毫升的裂解液（Reagent B）到15毫升錐形離心管里，混勻后，標(biāo)記為裂解工作液，放進(jìn)冰槽里備用。然后進(jìn)行下列操作。

• 準(zhǔn)備5至10瓶75cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶的細(xì)胞（5 X 10⁷），直至細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿整個(gè)培養(yǎng)表面
• 分別加入10毫升用戶自備的HANK平衡鹽緩沖溶液或PBS緩沖溶液到每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，覆蓋培養(yǎng)瓶表面
• 分別小心抽去緩沖溶液
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟2至3一次
• 分別加入3毫升用戶自備的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，鋪滿整個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)表面
• 放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱3分種
• 輕輕手擊震動(dòng)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫落
• 分別加入10毫升用戶自備的完全細(xì)胞培養(yǎng)液
• 移入一個(gè)50毫升錐形離心管
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為200g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的清理液（Reagent A）
• 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入5毫升預(yù)冷的裂解工作液
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育2分鐘，期間渦旋震蕩5秒一次
• 加入500微升預(yù)冷的強(qiáng)化液（Reagent D）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 在冰槽里孵育5分鐘，期間渦旋震蕩5秒二次（注意：參見注意事項(xiàng)9）
• 加入5毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E），輕輕搖動(dòng)試管混勻
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為1500g
• 小心移出上清液到另一個(gè)新的預(yù)冷的15毫升錐形離心管——此步驟去除細(xì)胞核和未溶解的細(xì)胞
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為10000g
• 小心抽去上清液，保留沉淀顆粒——此步驟獲得線粒體沉淀物
• （選擇步驟）加入3毫升預(yù)冷的保存液（Reagent E）
• （選擇步驟）放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)再次離心5分鐘，速度為10000g
• （選擇步驟）小心抽去上清液
• 加入100微升破膜液（Reagent F）到線粒體顆粒樣品中
• 加入1微升活性液（Reagent G）
• 渦旋震蕩15秒
• 放進(jìn)冰槽中孵育15分鐘
• 渦旋震蕩60秒
• 放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心2分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取上清液到新的1.5毫升離心管――此為所有可溶性線粒體蛋白系統(tǒng)
• 若暫時(shí)不予后續(xù)處理，保存在－20℃冰箱里
• 繼續(xù)進(jìn)行下列操作：

操作一、線粒體總蛋白定量檢測(cè)

1） 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用 Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－30030.1）

操作二、可溶性線粒體蛋白電泳

1） 移取20微升（1微克/微升）上清液到新的1.5毫升離心管

2） 加入20微升上樣液（Reagent H）

3） 渦旋震蕩15秒

4）放進(jìn)微型臺(tái)式離心機(jī)離心10秒，速度為500g（或2000RPM，例如eppendorf 5415）

5）煮沸5分鐘

6）上樣，進(jìn)行電泳操作和西方雜交

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為20次（5 X 10⁷細(xì)胞）操作
• 實(shí)際操作的細(xì)胞量與試劑用量成比例調(diào)整
• 操作時(shí)須戴手套
• 整個(gè)操作過程須在4℃條件下進(jìn)行
• 使用時(shí)，避免污染母液，尤其是裂解液（Reagent B）和保存液（Reagent E）
• 建議使用足夠的樣品量；建議使用5 X 10⁷細(xì)胞
• 建議嚴(yán)格控制操作時(shí)間
• 通常勻化次數(shù)為80下達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升勻漿物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加勻化次數(shù)。
• 通常孵育5分鐘達(dá)到80％的細(xì)胞裂解為理想狀態(tài)，但不同的組織類型會(huì)存在差異。用戶可以通過顯微鏡觀察3微升裂解物的細(xì)胞裂解程度：完整細(xì)胞呈現(xiàn)發(fā)亮的圓環(huán)。低于50％可以增加孵育時(shí)間和渦旋震蕩次數(shù)
• 對(duì)于難以裂解的細(xì)胞，例如HeLa細(xì)胞，采用物理勻漿法是優(yōu)先推薦的技術(shù)處理
• 通常5 X 10⁷細(xì)胞的線粒體含量為50微克線粒體蛋白

12． 本產(chǎn)品所獲得的線粒體純度和產(chǎn)量最為理想。通過調(diào)整10000g離心速度到3000至8000g，可以提高粗提的線粒體純化程度，但線粒體產(chǎn)量相應(yīng)減少

• 如果需檢測(cè)不可溶性線粒體蛋白，可保留線粒體裂解后的沉淀物，直接加入10微升上樣液（Reagent H）和10微升無(wú)離子水，然后繼續(xù)操作二的步驟3至6
• 線粒體蛋白須放在－70℃冰箱里儲(chǔ)存?zhèn)溆茫�避免反�?fù)凍融
• 本公司提供系列線粒體分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定無(wú)蛋白酶污染
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定蛋白萃取產(chǎn)量高
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定純化程度高