2017年1月1日遺傳學期刊Genetics（影響因子4.6）在線發(fā)表了上海大學生命科學學院祁巍巍老師的有關玉米突變體基因克隆與功能分析新文章，題為：Mitochondrial function and maize kernel development requires Dek2, a pentatricopeptide repeat protein involved in nad1 mRNA splicing。

在開花類的植物中，很多和呼吸相關的蛋白都是受到了線粒體基因組編碼基因以及細胞核編碼基因協(xié)同調(diào)控。三角狀五肽重復區(qū)(Pentatricopeptide repeat，PPR) 蛋白已經(jīng)有報道其參與了RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用。玉米籽粒突變體defective kernel 2 (dek2) 是一個典型的小籽粒以及發(fā)育遲緩的突變體。圖位克隆以及等位測試確認dek2編碼了一個新的線粒體中的P-type PPR蛋白。線粒體轉(zhuǎn)錄本分析表明dek2突變體引起了線粒體內(nèi)nad1內(nèi)含子1的剪切效率下降。dek2未成熟籽粒線粒體復合物分析表明復合物1顯著缺失。轉(zhuǎn)錄組測序與透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，由于AOXs蛋白的高表達，nad1適當?shù)募羟袑�線粒體功能以及線粒體的內(nèi)嵴至關重要。在該研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)dek2是一個新的PPR蛋白，其影響線粒體nad1內(nèi)含子1的剪切并且對于線粒體功能以及籽粒發(fā)育至關重要。

研究思路

研究結(jié)果

dek2影響籽粒正常發(fā)育

研究人員從玉米種質(zhì)中心獲取dek2的突變體并且對其與W22雜交，使其背景純化，以利于表型觀察。在對其表觀以及細胞層面上的觀察發(fā)現(xiàn)，dek2的突變體籽粒和野生型相比，顯著變小，百粒重只有野生型32%，總蛋白含量下降4%，醇溶蛋白下降21%，非醇溶蛋白含量上升38%，淀粉粒體積顯著減小，并且籽粒胚乳糊粉層發(fā)育受到顯著抑制（圖1，2）。

dek2的圖位克隆

為了對dek2進行基因定位，研究人員使用了圖位克隆的方法。經(jīng)過對438粒突變體籽粒的初定位以及3358粒籽粒的精細定位發(fā)現(xiàn)，GRMZM2G110851的單堿基SNP導致了該表型的產(chǎn)生（圖3）。

dek2編碼了一個P-type PPR蛋白

GRMZM2G110851在基因組上含有1893個堿基長度并且編碼了一個630個氨基酸的蛋白（圖3）。BLASTP的比對發(fā)現(xiàn)該基因編碼了一個P-type PPR蛋白，包含了10個PPR重復序列（圖3）。在第914位堿基G-A的突變導致了Gly-Glu的變化，從而產(chǎn)生了突變體表型。該結(jié)果同時被UniformMu轉(zhuǎn)座子突變的等位測試確認（圖3）。

dek2是一個保守的線粒體定位蛋白

PPR蛋白在植物中廣泛存在。研究人員為了確認dek2的進化地位，構(gòu)建了dek2全長蛋白序列的進化樹。結(jié)果表明，dek2同源基因廣泛存在于被子植物中，而在玉米中沒有同源基因（圖4）。對dek2的共聚焦顯微鏡亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，dek2與線粒體marker存在共定位，即dek2定位于線粒體內(nèi)嵴。

dek2影響nad1內(nèi)含子1的剪切

由于PPR蛋白可以與對應的線粒體或者葉綠體RNA互作，因此研究人員對18DAP dek2突變體胚乳以及野生型胚乳的線粒體轉(zhuǎn)錄本進行了分析。研究人員使用特異的引物擴增了線粒體cDNA，在35個基因中，只有nad1的成熟轉(zhuǎn)錄本在dek2中顯著下降（圖5）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，nad1內(nèi)含子1在dek2中顯著下降導致了全長成熟轉(zhuǎn)錄本表達量下降。

dek2影響了線粒體復合物I的聚集

為了深入研究線粒體的呼吸復合物，研究人員奮力了dek2 18DAP線粒體蛋白并且進行了非變性的BN-PAGE電泳。電泳結(jié)果顯示，復合物I含量顯著下降（圖6）。該結(jié)果證明了nad1內(nèi)含子1的剪切影響導致了復合物I功能的下降。

dek2影響了線粒體的正常功能

研究人員為了對dek2在籽粒發(fā)育過程中的作用有全局性的了解，分別選取了18DAP的dek2胚乳以及野生型胚乳進行了RNA轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq服務由上海伯豪提供）。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析，一共篩選到了2065個差異基因，其中1095個基因具有功能注釋。在GO歸類后，研究人員發(fā)現(xiàn)，這些基因主要聚集于GO: 004429 455 (Mitochondrial part, p-value=8.43E-13); GO: 0003942 (GTPase activity, 456 p-value=3.08E-08); GO: 0006119 (Oxidative phosphorylation, 457 p-value=0.000853); and GO: 0006626 (Protein targeting to mitochondrion, 458 p-value= 0.00488) 。其中，包含了一個維持TCA循環(huán)穩(wěn)定的Aox2基因。該基因在dek2中表達量上升1162倍。

原文出處：Qi W,Yang Y,Feng X,Zhang M,Song R.Mitochondrial Function and Maize Kernel Development Requires Dek2, a Pentatricopeptide Repeat Protein Involved in nad1 mRNA Splicing.Genetics. 2017

作者簡介
祁巍巍，女，復旦大學博士。2014年加入上海大學生命科學學院從事玉米籽粒突變體的克隆與功能分析。多次于Plant Cell，Plant Physiology，PLOS Genetics，Genetics以及BMC Biotechnology上發(fā)表研究性論文。工作內(nèi)容主要聚焦于玉米籽粒突變體的克隆與功能研究，CRISPR/Cas9系統(tǒng)在玉米中的作用等方向。其工作原創(chuàng)性高，大大拓展了人們在玉米籽粒遺傳學領域的認識，對玉米的分子機制研究做出了突出貢獻。