Mary Lame，Hua Yang, Sherri Naughton和Erin Chambers
沃特世公司(美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德)

關(guān)鍵詞

單克隆抗體，英夫利昔單抗，Remicade，蛋白定量，eXpress酶解

應(yīng)用優(yōu)勢(shì)

■ 簡(jiǎn)單、標(biāo)準(zhǔn)化的蛋白定量方法。
■ 普遍適用的優(yōu)化酶解套裝，為新藥研發(fā)省去了方法開發(fā)步驟。
■ 僅需4–6小時(shí)即可完成LC-MS分析的樣品前處理。
■ 分析英夫利昔單抗獲得了10 ng/mL的高靈敏度檢測(cè)限。

沃特世解決方案

ProteinWorks^TM eXpress酶解套裝
完整單克隆抗體檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品（部件號(hào)186006552）
ACQUITY UPLC^® Peptide BEH C₁₈,300Å 1.7 µm,2.1 mm × 150 mm肽分析專用柱（部件號(hào)186003687）
ACQUITY UPLC
Xevo® TQ-S質(zhì)譜儀
ProteinWorks µElution SPE凈化試劑盒

 簡(jiǎn)介

隨著越來(lái)越多的藥物開發(fā)聚焦于抗體或ADC等大分子，研究傳統(tǒng)“小分子”的科學(xué)家面臨著挑戰(zhàn)，這種挑戰(zhàn)不僅來(lái)源于小分子研究復(fù)雜且耗時(shí)的特點(diǎn)，還來(lái)自于使用LC-MS進(jìn)行蛋白定量時(shí)可能會(huì)涉及的多個(gè)工作流程。經(jīng)常使用ELISA 和其它免疫親和(IA )方法研究蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的研究人員也面臨同樣的問題。雖然IA 方法非常靈敏且操作簡(jiǎn)單，但其試劑重現(xiàn)性較差、缺乏標(biāo)準(zhǔn)化方法和交叉反應(yīng)、線性動(dòng)態(tài)范圍有限，還有其它一些缺點(diǎn)，由此推動(dòng)了轉(zhuǎn)向LC-MS的方法開發(fā)，尤其是在發(fā)現(xiàn)研究和早期開發(fā)/臨床前研究領(lǐng)域。然而，LC-MS工作流程包含多個(gè)子部分，每個(gè)子部分又包含許多步驟。有關(guān)特定試劑以及每個(gè)步驟的時(shí)間、溫度和試劑濃度都可影響靈敏度，導(dǎo)致我們很難快速獲得能夠達(dá)到期望檢測(cè)限的方法。本應(yīng)用紀(jì)要描述了使用ProteinWorks eXpress酶解套裝和方案快速、靈敏地對(duì)大鼠血漿中的英夫利昔單抗進(jìn)行定量分析(圖 1 )的方法。采用一套通用的樣品前處理方法，使用經(jīng)預(yù)先稱重且具有批次可溯源性的試劑，在一系列精心開發(fā)的通用型簡(jiǎn)單分步操作說明的指導(dǎo)下分析英夫利昔單抗，可達(dá)到10 ng/mL的LLOQ (定量下限)。

實(shí)驗(yàn)

樣品描述

首先使用蛋白A 瓊脂糖基96孔板對(duì)35 µL大鼠血漿中的英夫利昔單抗進(jìn)行免疫純化。然后使用ProteinWorks eXpress 酶解套裝和方案處理樣品以用于LC-MS分析。最后使用ProteinWorks µElution SPE 凈化試劑盒和方案純化特征肽段。

圖1. 英夫利昔單抗(Remicade)E的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

LC條件

LC系統(tǒng)：ACQUITY UPLC
檢測(cè)：Xevo TQ-S質(zhì)譜儀，ESI+
色譜柱：ACQUITY UPLC^® Peptide BEH C₁₈,300Å 1.7 µm,2.1 mm × 150 mm肽分析專用柱
柱溫：55 ℃
樣品溫度：10 ℃
進(jìn)樣體積：10 µL
流動(dòng)相A：0.1%甲酸水溶液
流動(dòng)相B：0.1%甲酸的乙腈溶液

梯度

MS條件

毛細(xì)管電壓(kV)：3
錐孔電壓(V)：30
電離源補(bǔ)償(V)：50
離子源溫度(℃)：150
脫溶劑氣溫度(℃)：600
錐孔氣流速(L/h)：150
碰撞氣體流速(mL/min)：0.15
噴霧器氣流(Bar)：7

數(shù)據(jù)管理

MassLynx® (4.1版)

結(jié)果與討論

隨著英夫利昔單抗的美國(guó)專利有效截止期限2017年越來(lái)越近1，CRO(合同研究機(jī)構(gòu))和生物仿制藥研究實(shí)驗(yàn)室對(duì)這種重要藥物的關(guān)注度也日益增加。然而，典型的工作流極其復(fù)雜，而且有多種選擇和選項(xiàng)。這使得開發(fā)高靈敏度方法充滿了挑戰(zhàn)。在本應(yīng)用紀(jì)要中，我們使用ProteinWorks eXpress酶解套裝來(lái)簡(jiǎn)化和精簡(jiǎn)流程。使用SPE方法，在總共不到6小時(shí)的時(shí)間內(nèi)就完成了英夫利昔單抗樣品的親和純化、酶解和肽段提取。該方法讓我們?cè)谕�一天即可開始采集數(shù)據(jù)，到第二天早上仍有多個(gè)96孔板正在運(yùn)行。我們同時(shí)監(jiān)控了多種獨(dú)特的特征肽段和一種通用人類肽段用于定量。使用來(lái)自重鏈的特征肽SINSATHYAESVK 時(shí)獲得了最佳靈敏度，英夫利昔單抗的其它特征肽段(DILLTQSPAILSVSPGER，輕鏈)及通用肽段(DSTYSLSSTLTLSK，輕鏈)的監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)被用于結(jié)果確證。將來(lái)自普通小鼠mAb標(biāo)準(zhǔn)品(部件號(hào)186006552)的特征肽段(SVSELPIMHQDWLNGK)作為內(nèi)標(biāo)。

使用試劑盒提供的優(yōu)化的方案和試劑，僅需35 µL血漿就能在英夫利昔單抗分析中達(dá)到10 ng/mL的檢測(cè)限(圖2)。表2匯總了各個(gè)肽段的標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性和準(zhǔn)確度。主要定量肽段SINSATHYAESVK 的靈敏度最高，在超過4個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)均保持線性，且標(biāo)準(zhǔn)曲線上所有點(diǎn)的平均準(zhǔn)確度大于98% 。另外兩個(gè)肽段在超過3.5個(gè)數(shù)量級(jí)的范圍內(nèi)保持線性，且標(biāo)準(zhǔn)曲線上所有點(diǎn)的平均準(zhǔn)確度大于99% 。

圖2. 大鼠血漿樣品的色譜圖，圖中顯示了濃度為10 ng/mL的英夫利昔單抗(與空白大鼠血漿樣品相比)。使用特征肽段SINSATHYAESVK 對(duì)英夫利昔單抗進(jìn)行定量。

表2. 用于定量大鼠血漿中英夫利昔單抗的特征肽段的線性動(dòng)態(tài)范圍和標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

此外，QC 樣品的準(zhǔn)確度和精度非常出色，所有變異系數(shù)(%CV)均小于6%。相關(guān)數(shù)據(jù)匯總于表3中。事實(shí)上，SINSATHYAESVK 肽段的QC 樣品的平均變異系數(shù)小于3%。

表3. 用于定量的所有英夫利昔單抗肽段QC 樣品的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

通過色譜數(shù)據(jù)評(píng)估可以明顯看出，峰寬和殘留內(nèi)源性組分分離方面的數(shù)據(jù)質(zhì)量提升幫助我們實(shí)現(xiàn)了低濃度水平的檢測(cè)并獲得了極高的準(zhǔn)確度和精度。圖3-5中所有特征肽段的QC 色譜圖都可以得出該結(jié)論(并且圖中已突出顯示)。

圖3. 英夫利昔單抗獨(dú)有的特征肽段SINSATHY AESVK的QC色譜圖。

 圖4.  英夫利昔單抗獨(dú)有的特征肽段DILLTQSPAILSVSPGER的QC 色譜圖。

圖5. 英夫利昔單抗的通用特征肽段DSTYSLSSTLTLSK 的QC色譜圖。

結(jié)論

我們應(yīng)用ProteinWorks eXpress酶解套裝，利用一系列典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線和大鼠血漿QC 樣品成功地對(duì)英夫利昔單抗進(jìn)行了純化。在保持出色線性和個(gè)位數(shù)精確度的同時(shí)，輕松達(dá)到了10 ng/mL的定量限。包含親和純化步驟在內(nèi)的總樣品前處理時(shí)間不超過6小時(shí)�？偟拿附鉁�(zhǔn)備時(shí)間僅2小時(shí)�；�于試劑盒的通用方法讓初學(xué)者能夠通過簡(jiǎn)單的分步方案和一系列標(biāo)準(zhǔn)化、經(jīng)預(yù)先檢測(cè)的試劑獲得超低的檢測(cè)限，還可確保實(shí)現(xiàn)所需的靈敏度，同時(shí)保證了此類方法能夠靈活轉(zhuǎn)換。

參考文獻(xiàn)

1. McKinsey and Company; Data Source: Evaluate Pharma, US Patent Expiration Dates.

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