β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體和多克隆抗體的制備

目前，在我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，青霉素和頭孢菌素等β-內(nèi)酰胺類抗生素對奶牛乳房炎等疾病的控制起著十分重要的作用。由于一些奶牛養(yǎng)殖商戶濫用抗生素以及未嚴(yán)格遵守休藥期，致使牛奶中抗生素殘留超標(biāo)，乳中殘留的抗生素嚴(yán)重危害食品安全和人體健康。我國政府對超過一定限量抗生素的原料乳實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)控制。國內(nèi)多數(shù)乳品企業(yè)對抗生素殘留超標(biāo)的牛乳采取降價(jià)收購或不收購，而一些不法奶站使用一些生物制劑降解牛乳中殘留的抗生素，生產(chǎn)出人造"無抗奶"。

經(jīng)過調(diào)研，初步判斷市售生物制劑的主要成分是β-內(nèi)酰胺酶，它是由革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生和分泌的多種酶組成的酶家族，相對分子質(zhì)量在28～32ku之間，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺類抗生素。β-內(nèi)酰胺酶能夠破壞青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)，使其失去活性。該酶的使用掩蓋了牛奶中實(shí)際含有的抗生素。崔生輝等人2007年曾在北京零售超市中采集5個(gè)廠家生產(chǎn)的、不同種類的牛奶樣品38個(gè)，其中63.2%的樣品檢測出β-內(nèi)酰胺酶。β-內(nèi)酰胺酶為我國禁用的食品添加劑之一，它可導(dǎo)致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低人們抵抗傳染病的能力，給消費(fèi)者的身心健康帶來危害。我國于2009年和2011年公布的食品和飼料中非法添加的非食用物質(zhì)名單中，β-內(nèi)酰胺酶（金玉蘭酶制劑）兩次上榜，且認(rèn)定的檢測方法為液相色譜法。

原乳中β-內(nèi)酰胺酶的檢測方法有微生物杯碟法、快速試劑盒法、液相色譜法和雙流向酶聯(lián)免疫法。微生物杯碟法成本低廉。試劑盒法和酶聯(lián)免疫法依據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)的基本特性，操作簡單，速度快，特異性好。液相色譜法具有操作時(shí)間短、靈敏度高、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但所需實(shí)驗(yàn)儀器要求較高。

本研究中制備β-內(nèi)酰胺酶的多克隆抗體和單克隆抗體，擬通過雙抗夾心法為后續(xù)的膠體金免疫層析試紙條的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)動物：日本大耳兔（雌性，兩月齡），北京金牧陽實(shí)驗(yàn)動物養(yǎng)殖有限責(zé)任公司；Balb/C小鼠（雌性，SPF級，六周齡）、昆明小鼠（18～22g），購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。

實(shí)驗(yàn)試劑：β-內(nèi)酰胺酶，Sigma公司；青霉素酶，中國藥品生物制品檢定所；牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉，北京經(jīng)日今典科技有限公司；單組份TMB顯色液，北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，北京優(yōu)博奧生物科技有限公司；HAT、 HT、PEG2000、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigma公司；小鼠SP2/0細(xì)胞，本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM低糖培養(yǎng)基，GIBCO公司；小鼠單克隆抗體亞型試劑盒，洛陽賽爾維實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

儀器和設(shè)備：96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板、細(xì)胞培養(yǎng)板，JETBIOFIL公司；酶聯(lián)免疫檢測儀、凝膠成像儀，BIO-RAD公司；紫外分光光度計(jì)，UNICO公司。

1.2 免疫抗原的選擇

使用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶兩種蛋白的分子質(zhì)量及純度。分離膠10%，積層膠4%，電泳緩沖液為甘氨酸。

1.3 多克隆抗體的制備

使用β-內(nèi)酰胺酶對3只日本大耳兔進(jìn)行免疫。對每只大耳兔，取700μgβ-內(nèi)酰胺酶，用pH7的0.1mol/LTris-HCL稀釋至 500μL，與等體積的弗氏完全佐劑混合，充分乳化后于兔子背部皮下和兩側(cè)腹股溝多點(diǎn)注射。之后的加強(qiáng)免疫使用同劑量免疫原與等體積的弗氏不完全佐劑充分乳化，背部皮下多點(diǎn)注射，每次免疫間隔兩周。自第3次免疫起，每次免疫4d后于兔子耳緣靜脈采血，分離血清，檢測免疫效果。五免后3d心臟采血，分離血清。

1.4 ELISA篩選方法的建立

1.4.1 包被原濃度的確定采用方陣法，用系列濃度稀釋的青霉素酶橫向包被96孔酶標(biāo)板，將倍比稀釋的一抗縱向加入，用間接ELISA法確定最佳抗原包被濃度。

1.4.2 包被條件的確定選擇4℃overnight，37℃1h，37℃2h3種方式包被，以確定最佳包被條件。

1.4.3 封閉液的選擇選擇0.2%明膠、5%脫脂奶粉、3%山羊血清、5%小牛血清、0.75%奶粉+2%BSA+5%蔗糖、3%BSA+0.05%吐溫+3%蔗糖、5%奶粉+0.05%吐溫+3%蔗糖7種封閉液封閉，確定最佳封閉液。

1.4.4 封閉時(shí)間的優(yōu)化封閉時(shí)間選擇0.5，1，2h，采用間接ELISA確定最佳封閉時(shí)間。

1.5 單克隆抗體的制備

1.5.1動物免疫將9只雌性Balb/C小鼠分為3組，高、中和低3個(gè)劑量組每次免疫分別為200，100和50μg/只。首次免疫取相應(yīng)劑量的 β-內(nèi)酰胺酶，溶于50μl 0.1mol/L Tris-HCL（pH7）中，于等體積的弗氏完全佐劑充分乳化后小鼠后頸背部多點(diǎn)注射。兩周后使用同劑量免疫原與弗氏不完全佐劑乳化作第2次免疫，于腹腔皮下注射。第

3次免疫后，ELISA法檢測小鼠抗血清的效價(jià)。在3組中選取效價(jià)最高的小鼠做融合，融合前3d腹腔注射相同劑量的抗原液作加強(qiáng)免疫。

1.5.2 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)用8-氮雜鳥嘌呤（20μg/mL）處理3代體外培養(yǎng)的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞，對數(shù)生長期時(shí)皮下注射Balb/C小鼠背部兩側(cè)，每只小鼠注射5×105～1×106個(gè)細(xì)胞。實(shí)體瘤直徑長至2～3cm時(shí)，無菌解剖摘取，200目的篩網(wǎng)研磨過濾，重新培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定生長。

1.5.3 細(xì)胞融合融合前1d使用昆明鼠培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞。取對數(shù)生長期的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫小鼠的脾細(xì)胞，用50％PEG2000按常規(guī)方法融合，使用建立的青霉素酶間接ELISA法檢測培養(yǎng)上清。選擇強(qiáng)陽性孔，用有限稀釋法連續(xù)亞克隆4～5次，直至克隆孔100％分泌抗β-內(nèi)酰胺酶抗體。將建立的穩(wěn)定、高效價(jià)分泌抗β-內(nèi)酰胺酶單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，傳3代及凍存復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，然后置液氮中保存。

1.5.4 腹水抗體的制備采用體內(nèi)誘生法制備腹水。取Balb/C小鼠腹腔注射滅菌石蠟油0.5mL/只，兩周后注射抗β-內(nèi)酰胺酶的雜交瘤細(xì)胞5×105個(gè)/只，1周后收集小鼠腹腔液。

1.6 抗體的特性分析

使用間接ELISA法對多克隆抗體和腹水中的單克隆抗體效價(jià)進(jìn)行測定，多克隆抗體以空白血清作陰性對照，單克隆抗體以SP2/0骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清為陰性對照；采用非競爭酶免疫試驗(yàn)對單克隆抗體的親和力進(jìn)行測定；使用亞型鑒定試劑盒對雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞型鑒定。采用秋水仙素裂解法對雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行染色體分析。使用Westernblotting對單克隆抗體的分子質(zhì)量和特異性進(jìn)行測定。

1.7 抗體純化

1.7.1 多克隆抗體的純化采用辛酸-飽和硫酸銨法純化抗β-內(nèi)酰胺酶的兔血清，2次滴加飽和硫酸銨的最終體積分?jǐn)?shù)分別為50%和40%。將沉淀用少量PBS溶解后轉(zhuǎn)入透析袋中，用PBS溶液透析48h，利用紫外分析法檢測透析液直至透析完全。

1.7.2 單克隆抗體的純化采用PEG6000沉淀法純化Balb/C小鼠的腹水，沉淀用50mmol/LTris-HCL溶液（pH8.0）溶解，冰浴除雜蛋白，即得粗提單克隆抗體，用SDS-PAGE對抗體純度進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 免疫原

通過SDS-PAGE分析β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶，兩種蛋白的分子質(zhì)量及純度見圖1。兩種蛋白在分子質(zhì)量為30ku處均有明顯的蛋白表達(dá)，分子質(zhì)量數(shù)據(jù)與預(yù)期相符。β-內(nèi)酰胺酶經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)100%，與說明書一致。青霉素酶經(jīng)Bandscan軟件分析，純度達(dá)61.4%，含有大量雜蛋白。使用純度較好的β-內(nèi)酰胺酶作為免疫原。

2.2 兔抗β-內(nèi)酰胺酶多克隆抗體效價(jià)

4免后，3只日本大耳兔的效價(jià)分別為1×106，2×106，1×106（見圖2）。其中2號大耳兔的效價(jià)最高，選取2號大耳兔的血清做ELISA的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.3 ELISA篩選方法

2.3.1 包被原濃度采用方陣法，用系列濃度稀釋的青霉素酶橫向包被96孔酶標(biāo)板，將倍比稀釋的一抗縱向加入（用"+"表示），每組加入50μg/mL的青霉素酶做抑制試驗(yàn)（用"-"表示），使用間接ELISA法確定最佳抗原包被濃度。當(dāng)包被原質(zhì)量濃度為5μg/mL，兔血清質(zhì)量濃度為1∶64000時(shí)，OD450 接近1，且抑制效果最好。使用5μg/mL青霉素酶作為包被原。

2.3.2 包被條件選擇4℃overnight，37℃1h，37℃ 2h 3種方式包被，以確定最佳包被條件。根據(jù)P/N的比值，確定4℃overnight為最佳包被濃度。

2.3.3 青霉素酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，含雜蛋白。7種封閉液中，使用3%BSA+0.05%吐溫+3%蔗糖封閉，特異性最好，封閉效果最佳。

2.3.4 封閉時(shí)間采用間接ELISA確定最佳封閉時(shí)間。當(dāng)封閉時(shí)間2h時(shí)，陰性值較低，P/N比值為最大，封閉效果最佳。

2.4單克隆抗體的制備

2.4.1 BALB/C小鼠免疫效果從免疫結(jié)果看，低劑量組（50μg/只）Balb/C小鼠產(chǎn)生抗體的效價(jià)最高，達(dá)1:128000。同時(shí)比較Balb/C小鼠的精神狀態(tài)，低劑量組較中、高劑量組的Balb/C小鼠體態(tài)活躍，被毛光亮。使用低劑量組的Balb/C小鼠脾臟進(jìn)行融合。

2.4.2 細(xì)胞篩選及亞克隆細(xì)胞融合后， 融合率為80%，陽性率為20.5%。經(jīng)4 次亞克隆，陽性率為100%，篩選出能穩(wěn)定分泌抗β-內(nèi)酰胺酶抗體的3株陽性細(xì)胞株，分別命名為C1，D1，F(xiàn)8。將F8連續(xù)傳代3 周及凍存復(fù)蘇后，檢測ELISA 效價(jià)，結(jié)果基本不變，說明所獲雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定。

2.5 抗體特性分析

2.5.1小鼠腹水中單抗效價(jià)及親和力測定結(jié)果用間接ELISA法檢測3株雜交瘤細(xì)胞無血清培養(yǎng)基上清效價(jià)（1∶32）～（1∶512）。將3株雜交瘤細(xì)胞均腹腔注射獲取腹水，3株雜交瘤細(xì)胞株中F8腹水的效價(jià)最高，選擇F8做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用非競爭酶免疫試驗(yàn)進(jìn)行測定。經(jīng)親和力常數(shù)公式計(jì)算，F(xiàn)8的親和力為6.4×107L/mol。

2.5.2 3株雜交瘤細(xì)胞亞型的鑒定結(jié)果使用單克隆抗體亞型鑒定試劑盒，對篩選出的3株單抗C1，D1，F(xiàn)8進(jìn)行亞型鑒定，這3株雜交瘤細(xì)胞均屬于IgM 亞型。

2.5.3 F8雜交瘤細(xì)胞株染色體的分析 計(jì)數(shù)100體數(shù)目總和基本一致（已知SP2/0細(xì)胞染色體數(shù)個(gè)處于有絲分裂中期的完整F8細(xì)胞，染色體數(shù)目62～68條，Balb/C小鼠脾細(xì)胞的染色體數(shù)目為96～104條（圖7），與SP2/0細(xì)胞和脾細(xì)胞的染色40條）。

2.5.4 Western-Blotting檢測F8的特異性Westernbloting鑒定表明，F(xiàn)8 腹水可與β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶發(fā)生特異性反應(yīng)（圖8），說明F8是針對β-內(nèi)酰胺酶和青霉素酶的特異性抗體。

2.6 F8雜交瘤細(xì)胞株單克隆抗體的純化

比較了辛酸-冷酒精法、辛酸-飽和硫酸銨法、PEG60003種方法，經(jīng)PEG6000方法純化的單克隆抗體雖然純度不高，但抗體效價(jià)保存最好。

3討論

金屬β-內(nèi)酰胺酶是一類活性依賴二價(jià)金屬陽離子的β-內(nèi)酰胺酶，該酶廣泛水解（包括碳青霉烯類、廣譜頭孢菌素類等）多種β-內(nèi)酰胺類抗生素，對常用 β-內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸、舒巴坦等）不敏感。依據(jù)分子生物學(xué)，Bush于1997年將當(dāng)時(shí)有序列資料的12種金屬酶分成3個(gè)亞群：B1，B2，B3。絕大多數(shù)金屬酶屬于B1亞群，該亞群的各種酶分子質(zhì)量相近（約為28ku），序列一致性大于23%。B2亞群與B1亞群的分子大小相近，但同源性較低。B3亞群只有9個(gè)氨基酸與其它金屬酶顯著不同，單體分子質(zhì)量為31.7ku。雖然各亞群金屬酶之間的氨基酸序列同源性不高，但是酶蛋白形成的立體結(jié)構(gòu)卻很類似，金屬酶中的關(guān)鍵殘基，尤其是形成金屬鍵的氨基酸殘基高度保守。鑒于β-內(nèi)酰胺酶的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，選擇純度較好的β-內(nèi)酰胺酶作為免疫原。為了使篩選的單克隆抗體能更好地識別β-內(nèi)酰胺酶，使用中檢所的青霉素酶作為包被原。目前，市售β-內(nèi)酰胺酶檢測膠體金試紙條多數(shù)采用的是間接法。間接法是利用β-內(nèi)酰胺酶酶解青霉素的原理，將牛奶樣品與微量青霉素混勻反應(yīng)。如果牛奶中存在一定濃度的β-內(nèi)酰胺酶，那么青霉素經(jīng)β-內(nèi)酰胺酶酶解后濃度減少。用試紙條檢測青霉素，判斷牛奶中是否存在β-內(nèi)酰胺酶，但是待測樣品要經(jīng)過多次離心、孵育等工序處理后方可使用試紙條進(jìn)行檢測。而本研究通過研制抗β-內(nèi)酰胺酶的單克隆抗體和多克隆抗體，使用雙抗夾心法，膠體金試紙條直接檢測。該方法的優(yōu)勢是減少反應(yīng)時(shí)間，優(yōu)化反應(yīng)步驟。

另外，細(xì)菌耐藥也能產(chǎn)生內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺。牛奶中內(nèi)源性β-內(nèi)酰胺酶的來源主要有2種途徑：一是牛體本身產(chǎn)生的，二是牛本身感染的某些有抗性的微生物在體內(nèi)不斷分泌表達(dá)β-內(nèi)酰胺酶。目前尚未有能區(qū)分產(chǎn)品中所含β-內(nèi)酰胺酶是人為添加還是耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的報(bào)道，這是監(jiān)管β-內(nèi)酰胺酶的一個(gè)新難題。只有加強(qiáng)畜牧業(yè)、奶業(yè)生產(chǎn)全過程管理，提高養(yǎng)殖人員的安全責(zé)任心，才是消除抗生素殘留，保障牛奶和奶制品安全的根本。