酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)測(cè)定法是一種在單細(xì)胞懸液中檢測(cè)分泌某種特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞和定量分析產(chǎn)生該特定蛋白質(zhì)的細(xì)胞頻率的有力工具。1983年，Crekinsky等運(yùn)用ELISPOT技術(shù)成功檢出分泌特異性抗體的細(xì)胞頻率，經(jīng)過(guò)不斷發(fā)展，目前該技術(shù)已廣泛用于檢測(cè)產(chǎn)生、分泌多種其他效應(yīng)分子的細(xì)胞(如細(xì)胞因子)。此方法操作簡(jiǎn)便，但卻能提供非常類(lèi)似于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的環(huán)境，監(jiān)測(cè)T細(xì)胞分泌的各類(lèi)細(xì)胞因子，預(yù)測(cè)體內(nèi)免疫系統(tǒng)相應(yīng)的進(jìn)一步免疫反應(yīng)。在美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院的國(guó)立過(guò)敏和傳染病研究所的HIV疫苗試驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)(HVTN)與疫苗研究中心(VRC)的實(shí)驗(yàn)室，ELISPOT方法被標(biāo)化和驗(yàn)證，已經(jīng)用作檢測(cè)艾滋病毒疫苗免疫原性終點(diǎn)的一個(gè)主要方法。

基本原理和實(shí)驗(yàn)方法及注意事項(xiàng)

1．基本原理和實(shí)驗(yàn)方法

ELISPOT檢測(cè)的是可釋放細(xì)胞因子的活化T淋巴細(xì)胞的數(shù)目。在ELSPOT方法中，硝酸纖維素膜的96孔板中預(yù)先包被了抗細(xì)胞因子的抗體，T細(xì)胞和抗原或肽段共同在板孔中孵育，受到刺激后的T細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞因子，分泌的細(xì)胞因子因與板孔中預(yù)先包被好的抗體發(fā)生結(jié)合而聚集在細(xì)胞所處部位，再加入酶標(biāo)記的二抗，最后加入底物，就會(huì)形成不可溶的帶有顏色的斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)代表著一個(gè)能夠產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞，這種方法較ELISA敏感200倍，無(wú)放射性，可以定量分析，精確性同LDA相當(dāng)(Miyahira et al_，1995)。

ELISPOT方法的基本原理一樣，但仍然會(huì)有一些變化，包括效應(yīng)細(xì)胞的種類(lèi)，可以是外周血T淋巴細(xì)胞，也可以是體外培養(yǎng)的T細(xì)胞�？乖�刺激物可以是肽或者蛋白質(zhì)，抗原呈遞細(xì)胞有外周血單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞或者腫瘤細(xì)胞系，檢測(cè)的指標(biāo)可以是各種細(xì)胞因子或者顆粒酶B等。圖10．7說(shuō)明了ELIPOT的原理和流程。

2．ELISPOT實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

(1)ELISPOT試驗(yàn)的檢測(cè)樣品和樣品的收集

ELISPOT試驗(yàn)在體外模擬體內(nèi)的環(huán)境，檢測(cè)活化的免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的狀況，因此其檢測(cè)對(duì)象是具有功能的細(xì)胞。對(duì)于人、猴等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，一般采用外周血新鮮分離后的單個(gè)核淋巴細(xì)胞，對(duì)于小鼠則多采用脾臟細(xì)胞。細(xì)胞的分離、保存、復(fù)蘇、培養(yǎng)、運(yùn)輸以及檢測(cè)環(huán)境和具體的操作等多個(gè)環(huán)節(jié)都可能會(huì)影響細(xì)胞的活力和功能，如果不能確保細(xì)胞的活力和功能，便不能得到免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的真實(shí)試驗(yàn)結(jié)果。目前外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離方法通常是加入無(wú)鈣的PBS等滲緩沖液倍比稀釋外周血后，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離出細(xì)胞，整個(gè)操作過(guò)程必須在無(wú)菌條件下完成，往淋巴細(xì)胞分離液中加人稀釋的全血時(shí)應(yīng)緩慢滴加，并且在整個(gè)操作過(guò)程中都應(yīng)該輕拿輕放，避免人為地將稀釋全血與分離液混合。外周血一經(jīng)采集應(yīng)該立即進(jìn)行分離，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在室溫下儲(chǔ)存12h以上，再分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞的活力將有所下降(Kierstead eta1．，2007)。

分離后的細(xì)胞應(yīng)該盡快進(jìn)行ELISPOT試驗(yàn)，否則需要用相應(yīng)的凍存方法將其放置在液氮內(nèi)保存，研究表明，在液氮內(nèi)保存180天的外周血單個(gè)核細(xì)胞，復(fù)蘇后細(xì)胞的活性保持在80％以上，并且ELISPOT試驗(yàn)的結(jié)果與新鮮分離細(xì)胞保持一致(Smith eta1．，2001)。目前許多疫苗的臨床試驗(yàn)需要將不同地區(qū)的樣本集中在中心實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，因此細(xì)胞的冷凍保存為此奠定了基礎(chǔ)，通過(guò)液氮運(yùn)輸凍存的細(xì)胞保證了疫苗臨床試驗(yàn)的完成。細(xì)胞運(yùn)輸過(guò)程中溫度的波動(dòng)變化是影響細(xì)胞活力的關(guān)鍵因素，為保證運(yùn)輸和保存細(xì)胞溫度的一致性，應(yīng)使用液氮進(jìn)行運(yùn)輸。

(2)ELISPOT試驗(yàn)中陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照以及試驗(yàn)孔的刺激物

通常免疫試驗(yàn)都需設(shè)立陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，ELISPOT試驗(yàn)也是如此，其陰性對(duì)照為試驗(yàn)細(xì)胞加上培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照為試驗(yàn)細(xì)胞加上陽(yáng)性刺激物，同時(shí)應(yīng)設(shè)立完全培養(yǎng)基對(duì)照，對(duì)于人、猴等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，陽(yáng)性刺激物可以選擇葡萄球菌腸毒素(staphylo-coccal enterotoxin B，SEB)、植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)、CEF肽庫(kù)或者PMA和ionomycin(或A23187)的混合物。CEF是含有32條巨細(xì)胞病毒(cy-tomegolo virus，CMV)、EB病毒(epstein-barr virus，EBV)和流感病毒(inflLlenzavirus)來(lái)源的T細(xì)胞MHCⅠ類(lèi)分子表位肽的混合物，其刺激反應(yīng)是一種特異性的反應(yīng)，與體外給予特異性肽段或抗原的刺激效果類(lèi)似，并且不同的人對(duì)CEF的反應(yīng)不同(Mwau and McMichael，2002)。小鼠脾臟細(xì)胞多選用刀豆蛋白A(ConA)作為陽(yáng)性刺激物。如果對(duì)陽(yáng)性刺激物缺乏反應(yīng)，說(shuō)明細(xì)胞在凍存或者復(fù)蘇中受損，該試驗(yàn)細(xì)胞則不能進(jìn)行ELISPOT試驗(yàn)。一般可以大量采集對(duì)以上刺激物有反應(yīng)的細(xì)胞，進(jìn)行分離凍存，在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)都復(fù)蘇細(xì)胞進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)作為陽(yáng)性對(duì)照，并且該陽(yáng)性對(duì)照也可以作為ELISPOT質(zhì)量控制的指標(biāo)。試驗(yàn)孔細(xì)胞的刺激物為根據(jù)試驗(yàn)的要求設(shè)計(jì)的特異性抗原或者肽庫(kù)，其刺激濃度根據(jù)抗原和肽庫(kù)性質(zhì)純度而定，一般情況下，肽庫(kù)的工作濃度為2ug／ml，蛋白質(zhì)的工作濃度為10ug／ml，實(shí)際工作中可以通過(guò)預(yù)試驗(yàn)摸索得到最佳條件。

(3)試驗(yàn)中其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

目前ELISPOT檢測(cè)試劑有已經(jīng)包被好細(xì)胞因子捕獲抗體的反應(yīng)板，也有需要預(yù)先包被抗體的試劑，不同包被抗體的濃度會(huì)影響最終反應(yīng)的斑點(diǎn)，如果包被抗體的濃度過(guò)低，反應(yīng)斑點(diǎn)偏大，并且有彌散現(xiàn)象，隨著抗體濃度的增加，反應(yīng)斑點(diǎn)會(huì)逐漸清晰致密，因此，在每次試驗(yàn)前需要預(yù)先摸索包被抗體的濃度或者根據(jù)說(shuō)明書(shū)的建議進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)孔細(xì)胞的數(shù)量會(huì)影響ELISPOT的試驗(yàn)結(jié)果，一般每孔細(xì)胞的數(shù)量在20萬(wàn)～40萬(wàn)可形成最大密度的單層細(xì)胞(Smith et a1．，2001)。根據(jù)不同的試驗(yàn)刺激物，可以相應(yīng)地調(diào)整試驗(yàn)孔細(xì)胞的濃度，在非特異性刺激物(SEB、PHA、PMA、ionomycin或者ConA)的作用下，一般每孔細(xì)胞數(shù)量為0．5萬(wàn)～5萬(wàn)個(gè)，在特異性刺激物CEF肽庫(kù)、相應(yīng)的抗原或肽庫(kù)的作用下，一般每孔細(xì)胞數(shù)量為5萬(wàn)～40萬(wàn)個(gè)(Sylvia et a1．，2006)。

大多數(shù)細(xì)胞可以直接進(jìn)行ELISPOT試驗(yàn)，不需要預(yù)先孵育，但是預(yù)先將細(xì)胞和刺激物進(jìn)行孵育，可以有效地去除巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，同時(shí)對(duì)于IL-10或者顆粒酶等，采用直接法很難得到較好的試驗(yàn)結(jié)果，必須通過(guò)預(yù)孵育法才能得到較好的試驗(yàn)結(jié)果。有文獻(xiàn)報(bào)道，凍存的細(xì)胞如果預(yù)先過(guò)夜孵育，可以更加有效地去除凋亡細(xì)胞的干擾(Marta et a1．，2007)。

細(xì)胞加入ELISPOT反應(yīng)板與刺激物共孵育的時(shí)間，一般在16h以上，最長(zhǎng)可孵育至24h或更長(zhǎng)。此外，在向反應(yīng)孔中加入細(xì)胞時(shí)應(yīng)緩慢垂直滴加，避免細(xì)胞聚集在板孔邊緣，建議每次實(shí)驗(yàn)時(shí)先加入反應(yīng)刺激物后再加入細(xì)胞。對(duì)于底部為PVDF膜的反應(yīng)孔，在加樣時(shí)應(yīng)該避免接觸板孔的底部，以免損壞PVDF膜。在細(xì)胞加人反應(yīng)板后，應(yīng)該盡量避免振搖反應(yīng)板，防止反應(yīng)斑點(diǎn)的拖尾現(xiàn)象。雖然ELISPOT試驗(yàn)相對(duì)其他細(xì)胞免疫檢測(cè)方法的操作步驟已經(jīng)相對(duì)簡(jiǎn)單，其操作步驟幾乎和ELISA反應(yīng)相似，但是在其洗板的過(guò)程中仍然需要小心處理，目前有手工洗板和機(jī)器洗板，在手工洗板的過(guò)程中，每次洗板后，應(yīng)該輕扣反應(yīng)板以去除板孔內(nèi)多余的水分，猛烈扣板可能會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)斑點(diǎn)的脫落。機(jī)器洗板可增加試驗(yàn)效率，并且在進(jìn)行具有感染性試驗(yàn)時(shí)可以保證實(shí)驗(yàn)人員的安全，但是并不能保證無(wú)菌操作，因此在細(xì)胞孵育之前的洗板步驟需要手工洗板。此外，培養(yǎng)基的類(lèi)型可以影響整個(gè)反應(yīng)的背景，如果選擇無(wú)血清的培養(yǎng)基可能會(huì)降低反應(yīng)孔的背景。

在ELISPOT的操作過(guò)程中，試驗(yàn)中應(yīng)用的培養(yǎng)基、包被抗體濃度、檢測(cè)抗體濃度、孵育時(shí)間、洗板的操作及顯色的時(shí)間等每一個(gè)試驗(yàn)環(huán)節(jié)都有可能影響試驗(yàn)的結(jié)果，每個(gè)操作者可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的條件建立相應(yīng)的ELISPOT反應(yīng)條件，從而得到較理想的試驗(yàn)結(jié)果。值得注意的一點(diǎn)是，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)于同一種細(xì)胞因子需要進(jìn)行各自試驗(yàn)條件的摸索，同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室在檢測(cè)不同細(xì)胞因子時(shí)，同樣應(yīng)該針對(duì)每一種細(xì)胞因子的試驗(yàn)條件進(jìn)行探索。

(4)ELISPOT實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷、分析以及陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)

ELISPOT方法的缺點(diǎn)在于：人工操作計(jì)數(shù)造成的誤差、點(diǎn)的大小形狀變化造成的誤差以及實(shí)驗(yàn)操作者主觀操作造成的誤差都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。目前已有商品化計(jì)算機(jī)成像分析系統(tǒng)，大大增加了計(jì)數(shù)免疫斑點(diǎn)的精確性和速度。其中美國(guó)CTL公司產(chǎn)品占有率較高。通過(guò)分析斑點(diǎn)的形狀、大小、密度，可以排除非特異性斑點(diǎn)和確定單個(gè)T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的量。

ELISPOT、試驗(yàn)已經(jīng)廣泛地應(yīng)用在HIV疫苗的臨床試驗(yàn)中，用于評(píng)價(jià)HIV疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫效果。ELISPOT試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)目前分為三類(lèi)：經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)、Permutation-based resampling標(biāo)準(zhǔn)和Distribution-free resampling標(biāo)準(zhǔn)(Zoe et a1．，2006)。

經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的具體規(guī)定為：在每孔20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中，加人相應(yīng)抗原或肽段刺激的反應(yīng)孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的平均數(shù)量至少為11個(gè)，并且是陰性對(duì)照孔SFC平均數(shù)量的4倍，如果符合上述兩個(gè)條件，則試驗(yàn)組為陽(yáng)性反應(yīng)。經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)是試驗(yàn)者根據(jù)ELISPOT、的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)得到的判斷陽(yáng)性的標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用相對(duì)簡(jiǎn)單，但是存在一些不可避免的缺點(diǎn)，如經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的準(zhǔn)確性較差，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)得到的結(jié)果往往特異性和靈敏度都相對(duì)較差。ELISPOT、試驗(yàn)的操作方法的各項(xiàng)條件是多樣化的，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都不是完全相同的，而經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)往往是根據(jù)某一特定試驗(yàn)條件所制訂的標(biāo)準(zhǔn)。嚴(yán)格地講，試驗(yàn)條件完全相同的實(shí)驗(yàn)室才可以按照該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，如果試驗(yàn)條件不同的實(shí)驗(yàn)室都參照經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)判斷疫苗的細(xì)胞免疫效果，可能有些實(shí)驗(yàn)室的判斷結(jié)果會(huì)有不準(zhǔn)確的信息存在。

Permutation-based resampling標(biāo)準(zhǔn)在經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上應(yīng)用了統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，相對(duì)地校正了經(jīng)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的一些缺點(diǎn)。該標(biāo)準(zhǔn)的具體規(guī)定為：根據(jù)T=(YE-YC)/Sp得到P值，從而判斷結(jié)果。YE代表相應(yīng)抗原或肽段刺激的反應(yīng)孔斑點(diǎn)形成細(xì)胞(SFC)的平均數(shù)量，YE至少為10SFC/200 000個(gè)PBMC，Yc代表陰性對(duì)照孔SFC平均數(shù)量，SP代表標(biāo)準(zhǔn)差，應(yīng)用該標(biāo)準(zhǔn)在一定程度上提高了檢測(cè)的特異性。

Distribution-free resampling標(biāo)準(zhǔn)是一種更新的陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合了統(tǒng)計(jì)方法，計(jì)算比Permutation-based resampling標(biāo)準(zhǔn)更為簡(jiǎn)單，并且該方法在一定程度上避免刺激肽庫(kù)中不同肽段的相互影響，可以更好地應(yīng)用在疫苗的臨床試驗(yàn)上