免疫熒光技術(shù)的實驗方法及其分類
免疫熒光技術(shù)的實驗方法及其分類
一、免疫標(biāo)記法及其分類
1.熒光免疫法
原理是應(yīng)用一對單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強度與Mb濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點。
以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然后加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物。最后根據(jù)熒光強度，即可對蛋白抗原進行定量。
傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時間分辨熒光免疫測定法是以具有特長壽命的稀土金屬如銪，作為標(biāo)記物，加入正常液后激發(fā)測定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。
2.放射免疫法
放射免疫法是以過量的未標(biāo)記抗原與放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗原，競爭性地與抗體結(jié)合，形成有放射性的抗原—抗體復(fù)合物與無放射性的抗原—抗體復(fù)合物，并有過剩的標(biāo)記抗原與未標(biāo)記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原分離，分別測定其放射性強度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可對未標(biāo)記的待測抗原進行定量。
RIA法測定血清蛋白靈敏度高、特異性強，可準(zhǔn)確定量到ng／ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時長，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應(yīng)用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡化，并已有商品試劑盒供應(yīng)，使用方便。
3.酶聯(lián)免疫法(ELISA)
ELISA法有競爭法和夾心法兩種。競爭法是基于標(biāo)準(zhǔn)或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競爭性地與單克隆抗體相結(jié)合的原理而建立，該法的最低檢測限為10μg／L，線性范圍達1 000ug／L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關(guān)性(r＝0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強，精密度好，操作簡單，適用于多份標(biāo)本的檢測，不需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測。
以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復(fù)合物。接著加入酶標(biāo)二抗，形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物。最后加入底物，由酶催化底物生成產(chǎn)物。通過產(chǎn)物的生成量即可對蛋白抗原進行定量。
4.偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法
利用了一個親和素分子可以與4個生物素分子結(jié)合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。
5.時間分辨熒光免疫分析
時間分辨熒光免疫分析（Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA）是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點，用時間分辨技術(shù)測量熒光，同時檢測波長和時間兩個參數(shù)進行信號分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。
6.解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?/STRONG>
解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觯―issociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA）是時間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪（Eu）連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強度非常弱，因此加入一種增強劑，使Eu3 從復(fù)合物上解離下來，自由Eu3 同增強劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團，這種分子團在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強的熒光，信號增強了百萬倍。因為這種分析方法使用了解離增強步驟，因此稱為解離增強鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥?BR>
二、熒光抗體染色方法及其分類
1.直接染色法
將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時間的染色，洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點是：特異性高，操作簡便，比較快速。缺點是：一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照，抑制試驗對照。
2.間接染色法
如果檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（第一抗體）與抗原標(biāo)本進行反應(yīng)，作用一定時間后，洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體即抗球蛋白抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定或與熒光素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標(biāo)記的抗體起著雙重作用，對抗原來說起抗體的作用，對第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標(biāo)本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。
由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標(biāo)記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動物血清球蛋白免疫其他動物來制備。
間接染色法的優(yōu)點是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體；用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點是：由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時較難，操作繁瑣，對照較多，時間長。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽性標(biāo)本對照，還應(yīng)設(shè)有中間層對照（即中間層加陰性血清代替陽性血清）。
3.抗補體染色法
抗補體染色法簡稱補體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體（待檢血清）。染色程序也分二步：先將未標(biāo)記的抗體和補體加在抗原標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，水洗，然后再加標(biāo)記的抗補體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物，則補體便被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，第二步加入的熒光素標(biāo)記的抗補體抗體便與補體發(fā)生特異性反應(yīng)，使之形成抗原-抗體-補體-抗補體抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光。
抗補體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點，此外，還有其獨特的優(yōu)點：即只需要一種標(biāo)記抗補體抗體，便能檢測各種抗原-抗體系統(tǒng)。因為補體的作用沒有特異性，它可以與任何哺乳動物的抗原-抗體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。它的缺點是參與反應(yīng)的成分多，染色程序較復(fù)雜，比較麻煩。
除上述三種方法外，還有在此基礎(chǔ)上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補體法等等。
