在人類與疾病斗爭(zhēng)的漫長(zhǎng)歷史中，腦瘤始終是一塊難啃的 “硬骨頭”。其中，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）作為一種極為兇險(xiǎn)的腦部腫瘤，嚴(yán)重威脅著患者的生命，給無(wú)數(shù)家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在諸多領(lǐng)域取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的高侵襲性和復(fù)雜性，使其治療成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。

VU大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表于《Angiogenesis》的“Optical clearing and fluorescence deep-tissue imaging for 3D quantitative analysis of the brain tumor microenvironment”研究文章，提出了腦部腫瘤組織的整體組織透明、3D成像和3D空間定量統(tǒng)計(jì)分析的工作流程，為腦部腫瘤研究帶來(lái)了全新的思路和方法。

研究背景
1、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的挑戰(zhàn)
GBM是一種極具侵襲性的腦部腫瘤，其難治性部分歸因于腫瘤細(xì)胞廣泛而彌漫地浸潤(rùn)周圍微環(huán)境。這種浸潤(rùn)改變了腦內(nèi)的微血管結(jié)構(gòu)、組織灌注以及大腦整體架構(gòu)，導(dǎo)致腫瘤與微環(huán)境之間的關(guān)系錯(cuò)綜復(fù)雜。深入理解GBM細(xì)胞在空間上的異質(zhì)性及其與微血管、血管間組織微環(huán)境的相互關(guān)系，對(duì)于攻克這一疾病至關(guān)重要，而這迫切需要更先進(jìn)的三維分析技術(shù)來(lái)研究腦部腫瘤組織。

2、現(xiàn)有成像技術(shù)的局限
在腦部腫瘤研究中，光學(xué)3D分析技術(shù)雖然有望在細(xì)胞分辨率下對(duì)腦結(jié)構(gòu)成像，成為連接CT、PET、MRI與傳統(tǒng)顯微組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的橋梁，但傳統(tǒng)的活體共聚焦顯微鏡技術(shù)卻存在諸多不足。動(dòng)物的鎮(zhèn)靜時(shí)間、有限的成像深度、狹小的視野以及熒光標(biāo)記相關(guān)的限制等因素，都制約了其在深入研究中的應(yīng)用。盡管如此，體外光學(xué)成像技術(shù)的出現(xiàn)為研究提供了新的方向，其不受活體成像中部分因素的限制，為更精準(zhǔn)地研究腦部腫瘤微環(huán)境帶來(lái)了可能。

3、光學(xué)切片技術(shù)的興起
長(zhǎng)期以來(lái)，3D結(jié)構(gòu)的光學(xué)成像依賴于組織切片技術(shù)，但這一過(guò)程需要獲取并精確對(duì)齊大量組織切片，操作極為繁瑣且容易出錯(cuò)。隨著技術(shù)的發(fā)展，光學(xué)切片技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該技術(shù)通過(guò)透明組織使其“光學(xué)穿透”，從而實(shí)現(xiàn)深層組織的熒光激發(fā)和檢測(cè)。同時(shí)，多光子顯微鏡和光片顯微鏡等設(shè)備的改進(jìn)，以及ImageJ、Amira和Imaris等軟件工具的開(kāi)發(fā)，也為光學(xué)切片技術(shù)的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

研究方法
1、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
動(dòng)物模型建立、活體成像操作及光聲成像評(píng)估。

2、整體組織透明與標(biāo)記方法
CLARITY和iDISCO兩種整體組織透明方法。

3、圖像采集與處理
使用多種顯微鏡進(jìn)行圖像采集，利用FIJI軟件對(duì)雙光子圖像進(jìn)行重建分析。

與其他方法的比較
1、活體成像的深度限制
研究人員通過(guò)在小鼠顱骨上應(yīng)用顱窗并利用雙光子成像技術(shù)，對(duì)小鼠腦微血管進(jìn)行了活體成像研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管通過(guò)該窗口能夠清晰識(shí)別用于定位的淺表血管，但成像深度卻十分有限，最大僅能達(dá)到200μm。這一深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足以深入研究腦內(nèi)相關(guān)區(qū)域，因此促使研究團(tuán)隊(duì)尋求更有效的體外成像方法，以更好地觀察和量化腫瘤細(xì)胞與腦微環(huán)境之間的關(guān)系，特別是聚焦于腦部腫瘤血管系統(tǒng)。

2、體外成像的顯著優(yōu)勢(shì)
為了實(shí)現(xiàn)對(duì)整個(gè)小鼠腦區(qū)域的微觀可視化，研究采用了CLARITY和iDISCO兩種整體組織透明方法對(duì)小鼠腦組織進(jìn)行處理。CLARITY方法使組織尺寸擴(kuò)張約1.5倍，而iDISCO方法則導(dǎo)致組織直徑穩(wěn)定收縮約1.2倍。在對(duì)經(jīng)CLARITY處理后的頂葉皮質(zhì)區(qū)域進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)雙光子顯微鏡查看微血管，能夠在2000μm的深度下清晰成像，并且與活體成像中隨著深度增加信號(hào)迅速衰減不同，整體組織透明組織中的熒光信號(hào)強(qiáng)度在整個(gè)2000μm的工作距離內(nèi)都能保持在表面信號(hào)強(qiáng)度的65%以上。因此，體外成像技術(shù)在深度和信號(hào)強(qiáng)度保持方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。

3、健康腦組織血管的量化分析
利用健康小鼠腦組織，研究團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種用于量化血管系統(tǒng)的工作流程。通過(guò)對(duì)染色的血管進(jìn)行計(jì)算建模，發(fā)現(xiàn)小腦不同區(qū)域（如顆粒層和分子層）的血管在數(shù)量、長(zhǎng)度、表面積、直徑和體積等方面存在顯著差異。這一結(jié)果不僅證實(shí)了之前關(guān)于不同腦區(qū)血管差異的研究發(fā)現(xiàn)，也進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了在研究細(xì)胞與腦微環(huán)境的空間關(guān)系時(shí)，選擇解剖學(xué)上明確且相同的區(qū)域進(jìn)行比較的重要性。

4、腫瘤細(xì)胞與血管的關(guān)系剖析
★ 血管染色穩(wěn)定性
為了探究腫瘤細(xì)胞是否影響血管內(nèi)皮糖萼，研究人員通過(guò)原位異種移植人類細(xì)胞構(gòu)建了腦部腫瘤模型。腫瘤生長(zhǎng)并未顯著改變對(duì)腦微血管的染色模式，這意味著在腫瘤存在的情況下，仍可可靠地標(biāo)記腦微血管。

★ GBM血管變化建模
運(yùn)用iDISCO方法對(duì)固定不同時(shí)長(zhǎng)的異種移植腦部腫瘤組織進(jìn)行整體組織透明處理后，研究人員發(fā)現(xiàn)腫瘤核心區(qū)域的血管分支數(shù)量、總長(zhǎng)度和表面積均有所增加，而平均血管直徑相較于對(duì)側(cè)相應(yīng)區(qū)域略低，但最終導(dǎo)致腫瘤核心與對(duì)側(cè)區(qū)域的血管體積相當(dāng)。這一變化反映了腫瘤微環(huán)境對(duì)血管系統(tǒng)的重塑作用，為深入理解腫瘤血管生成機(jī)制提供了重要依據(jù)。

★ GBM細(xì)胞分布特征
通過(guò)對(duì)GBM細(xì)胞在腫瘤核心、深部灰質(zhì)和白質(zhì)等不同解剖區(qū)域的分布進(jìn)行量化分析，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤核心區(qū)域的細(xì)胞密度顯著高于浸潤(rùn)前沿區(qū)域。同時(shí)，計(jì)算腫瘤細(xì)胞與微血管之間的距離發(fā)現(xiàn)，在腫瘤核心區(qū)域，部分腫瘤細(xì)胞距離微血管較遠(yuǎn)，而在深部灰質(zhì)的浸潤(rùn)前沿，腫瘤細(xì)胞更傾向于靠近微血管分布，這可能暗示了GBM細(xì)胞在深部灰質(zhì)區(qū)域的遷移與血管密切相關(guān)，或者是腫瘤核心區(qū)域細(xì)胞增殖導(dǎo)致血管間距離增大。此外，研究還觀察到部分腫瘤細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞突起相互連接形成類似多細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)，這一發(fā)現(xiàn)與之前的研究結(jié)果相符，進(jìn)一步揭示了GBM細(xì)胞在腦內(nèi)的復(fù)雜分布模式和相互作用方式。

研究結(jié)論
1、技術(shù)創(chuàng)新的價(jià)值
通過(guò)CLARITY和iDISCO等整體組織透明方法，研究人員能夠制備出透明的腦組織樣本，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腦微血管架構(gòu)以及腫瘤細(xì)胞在腦部腫瘤微環(huán)境中分布的三維可視化研究。這種創(chuàng)新技術(shù)克服了傳統(tǒng)成像方法在深度和分辨率上的局限性，為深入研究腦部腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞與血管關(guān)系提供了有力工具。

2、揭示腫瘤細(xì)胞分布規(guī)律
研究結(jié)果詳細(xì)揭示了GBM細(xì)胞在腦內(nèi)不同區(qū)域的分布差異，包括腫瘤核心與浸潤(rùn)前沿、灰質(zhì)與白質(zhì)區(qū)域之間的細(xì)胞密度和與微血管距離的變化。這些發(fā)現(xiàn)有助于深入理解GBM細(xì)胞的遷移模式，如在灰質(zhì)區(qū)域腫瘤細(xì)胞傾向于沿血管遷移，而在白質(zhì)區(qū)域細(xì)胞遷移可能涉及多種途徑，包括沿著白質(zhì)纖維束遷移等。此外，腫瘤細(xì)胞之間形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也為研究腫瘤細(xì)胞間通訊和集體行為提供了新的視角。

3、開(kāi)辟研究新路徑
通過(guò)結(jié)合整體組織透明技術(shù)、熒光深層組織成像和3D空間定量統(tǒng)計(jì)分析方法，能夠更全面、精確地研究腦部腫瘤細(xì)胞與微環(huán)境之間的相互作用，這將有助于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和開(kāi)發(fā)更有效的治療策略，為未來(lái)腦部腫瘤治療帶來(lái)新的希望。

展望未來(lái)
在抗體染色方面，雖然已注意到某些抗體需要優(yōu)化，但未來(lái)還需更系統(tǒng)地探索不同抗體在大組織染色中的最佳條件，包括抗體濃度滴定、組織預(yù)處理方法等，以提高染色效果和特異性。此外，還可進(jìn)一步探索其他具有特異性結(jié)合能力的分子探針，以實(shí)現(xiàn)對(duì)腦部腫瘤微環(huán)境中更多細(xì)胞類型和分子標(biāo)記的可視化研究。

在未來(lái)研究中，應(yīng)更加關(guān)注這些技術(shù)在臨床轉(zhuǎn)化方面的潛力，且腦部腫瘤研究涉及多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，如神經(jīng)科學(xué)、腫瘤學(xué)、生物醫(yī)學(xué)工程和影像學(xué)等。未來(lái)需要進(jìn)一步加強(qiáng)多學(xué)科之間的合作與融合，整合不同學(xué)科的理論和技術(shù)優(yōu)勢(shì)。例如，結(jié)合神經(jīng)科學(xué)對(duì)腦功能和神經(jīng)回路的理解，以及生物醫(yī)學(xué)工程在新型成像設(shè)備和材料開(kāi)發(fā)方面的創(chuàng)新，推動(dòng)腦部腫瘤研究在基礎(chǔ)機(jī)制探索和臨床應(yīng)用方面取得更大突破。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于：Lagerweij, T., Dusoswa, S.A., Negrean, A. et al. Optical clearing and fluorescence deep-tissue imaging for 3D quantitative analysis of the brain tumor microenvironment. Angiogenesis 20, 533–546 (2017). https://doi.org/10.1007/s10456-017-9565-6.