翼鬃麒科技（北京）有限公司自主研發(fā)型號YZQ-201A藻類光合儀 助力科研實(shí)驗(yàn)，完成本文章中必要的部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)
 

作者：朱寅杰、姚詩詩
通訊作者：陶益
通訊單位：清華大學(xué)深圳國際研究生院

圖片摘要
 
成果簡介
近日，清華大學(xué)深圳國際研究生院陶益副教授團(tuán)隊(duì)在環(huán)境領(lǐng)域?qū)W術(shù)期刊Water Research上發(fā)表了題為“Variable cyanobacterial death modes caused by ciprofloxacin in the aquatic environment: Prioritizing antibiotic-photosynthetic protein interactions for risk assessment”的研究論文。文中識別了環(huán)境濃度環(huán)丙沙星在典型水華藍(lán)藻銅綠微囊藻細(xì)胞內(nèi)的多重靶位點(diǎn)：除了結(jié)合DNA回旋酶造成DNA損傷之外，環(huán)境濃度環(huán)丙沙星在不同暴露水平下對銅綠微囊藻不同光系統(tǒng)反應(yīng)中心產(chǎn)生差異化結(jié)合。這種差異化結(jié)合造成藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)不同的碳氮代謝調(diào)控模式，使藻細(xì)胞在DNA損傷下執(zhí)行不同的程序性死亡模式。本研究為進(jìn)一步評估和預(yù)測環(huán)境濃度抗生素水生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供了新的見解。

引言
不斷排放到水環(huán)境中的抗生素能夠和不同的光合蛋白表現(xiàn)出高親和力結(jié)合，干擾光合生物的能量代謝和生長，進(jìn)而影響水生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)力。然而，當(dāng)前的研究將抗生素對光合生物的亞致死作用主要?dú)w因于對光系統(tǒng)II（PSII）蛋白的損傷，而忽略了PSI 蛋白作為潛在靶標(biāo)的可能。在本研究中，我們研究了環(huán)境濃度（3-8 μg/L）環(huán)丙沙星（CIP）對典型水華藍(lán)藻銅綠微囊藻的致死效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，3-8 μg/L CIP通過損傷藍(lán)藻細(xì)胞的DNA造成細(xì)胞程序性死亡。此外，在不同暴露水平下，CIP對不同光合蛋白存在差異化損傷并影響了藍(lán)藻細(xì)胞的死亡表型。具體來說，3 μg/L CIP 僅同PSII的反應(yīng)中心D1蛋白結(jié)合，上調(diào)了細(xì)胞三羧酸循環(huán)和脯氨酸分解代謝，以獲取ATP。這有利于細(xì)胞類凋亡（AL-RCD）的執(zhí)行。然而，除了結(jié)合PSII上的D1蛋白之外，8 μg/L CIP還能夠和PSI的鐵-硫簇中心蛋白結(jié)合，造成整條電子傳遞鏈的崩潰，誘導(dǎo)碳和精氨酸饑餓。這使藻細(xì)胞死亡模式從AL-RCD轉(zhuǎn)變?yōu)?nbsp;mazEF系統(tǒng)介導(dǎo)的RCD（mazEF-RCD）。此外，在AL-RCD和mazEF-RCD細(xì)胞中，MC-LR的被動釋放水平和生物合成能力分別得到增強(qiáng)，表明CIP 暴露后MC-LR風(fēng)險(xiǎn)的提升。本研究強(qiáng)調(diào)了抗生素與不同光合蛋白之間復(fù)雜的相互作用，這些相互作用能夠改變不同環(huán)境濃度暴露水平下抗生素的致死效應(yīng)。從化合物-光合蛋白相互作用的角度出發(fā)，該項(xiàng)研究能為評估和預(yù)測環(huán)境濃度抗生素的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供新的視角。

圖文導(dǎo)讀
環(huán)境濃度CIP和光系統(tǒng)反應(yīng)中心的結(jié)合

圖1：環(huán)境濃度CIP脅迫下藍(lán)藻(a) PSII光量子產(chǎn)率和(b) 光系統(tǒng)電子傳遞速率的變化。8 μg/L CIP暴露組vs3μg/L CIP暴露組差異基因的(c) GO富集分析和(d) 火山圖。(e) CIP和PSII D1蛋白以及PSI Fe-S簇中心蛋白的分子對接。

首先，通過光合電子傳遞速率檢測、PHYTO-PAM檢測和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析評估了CIP暴露對銅綠微囊藻細(xì)胞光合系統(tǒng)的損傷。3 μg/L以上的CIP對PSII的有效光量子產(chǎn)率[Y(II)]造成濃度依賴的持久性損傷（圖1a），并且降低了PSII中的電子傳遞速率（圖 1b）。在3和8 μg/L CIP暴露的藍(lán)藻細(xì)胞中，PSII的電子傳遞速率分別降低了38%和97%（圖1b）。然而，在8 μg/L CIP暴露的藍(lán)藻細(xì)胞中，PSI的電子傳遞完全崩潰（圖 1b）；而在3 μg/L CIP暴露下，藍(lán)藻細(xì)胞PSI的電子傳遞速率并沒有顯著變化（下降約∼10%），表明該暴露水平對PSI微弱的損傷。通過比較3和8 μg/L CIP暴露下細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，8 μg/L CIP暴露下藍(lán)藻細(xì)胞的差異基因（DEGs）顯著富集在PSI中（圖 1c）。在這些DEGs中，psaC 是變化顯著的下調(diào)基因[-1.21 log2|FC|，F(xiàn)DR = 0.00068]。

CIP對PSII D1蛋白具有更高的親和力，但在高暴露水平下其也能夠結(jié)合PSI Fe-S簇中心蛋白。通過分子對接計(jì)算驗(yàn)證上述結(jié)果。模擬計(jì)算結(jié)果顯示（圖 1e），CIP通過氫鍵和疏水作用力同PSII的D1蛋白和PSI的Fe-S簇中心蛋白分別產(chǎn)生-9.28和-5.18 kcal/mol的結(jié)合能，表明CIP對PSII D1蛋白有更高的親和力；但是隨著暴露水平的增加，CIP同PSI Fe-S簇中心蛋白的高親和力導(dǎo)致了CIP對PSI的損傷。

環(huán)境濃度CIP造成的細(xì)胞裂解和毒素風(fēng)險(xiǎn)

圖2：環(huán)境濃度CIP脅迫下藍(lán)藻(a) 比生長速率，(b)死亡率和(c)(d) 細(xì)胞尺寸的變化。MC-LR(e) 釋放率和(f) 單細(xì)胞合成能力的變化。

3和8 μg/L CIP造成藍(lán)藻細(xì)胞在21天暴露時(shí)間內(nèi)持續(xù)的細(xì)胞裂解，裂解率達(dá)到70%左右（圖 2a）。同時(shí)，在細(xì)胞持續(xù)裂解的過程中，藍(lán)藻細(xì)胞的雙鏈DNA（dsDNA）含量降低，死亡率增加（圖 2b）。3 μg/L CIP暴露使藍(lán)藻細(xì)胞的死亡率在7天內(nèi)持續(xù)增加至60%左右（圖 2b）。然而，在8 μg/L CIP暴露下，細(xì)胞死亡率在7天內(nèi)穩(wěn)定在25%左右（圖 2b），這表明環(huán)境濃度CIP 在藍(lán)藻細(xì)胞中引發(fā)了不同的死亡模式。除此之外，3和8 μg/L CIP暴露造成細(xì)胞尺寸的顯著變大，增長至對照組細(xì)胞的1.5倍左右（圖 1c和1d）。以上結(jié)果表明環(huán)境濃度暴露下藍(lán)藻細(xì)胞DNA受到不可修復(fù)的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的死亡和裂解。

3和8 μg/L CIP造成了不同的MC-LR風(fēng)險(xiǎn)模式。3 μg/L CIP暴露使得MC-LR的被動釋放水平在7天內(nèi)較對照組顯著提升9倍（圖 1e），而單細(xì)胞合成能力得到抑制(圖 1f)。8 μg/L CIP暴露則使得MC-LR的單細(xì)胞合成能力在7天內(nèi)較對照組顯著提升4倍（圖1f），而釋放水平則沒有顯著的變化（圖 1e）。

環(huán)境濃度CIP造成的不同細(xì)胞程序性死亡模式

圖3：環(huán)境濃度CIP脅迫下藍(lán)藻(a) 膜通透性和磷脂酰絲氨酸（PS）外翻以及(b) Caspase-3酶活性和DNA斷裂水平的變化。(c) 不同程序性死亡模式下細(xì)胞形貌的觀察。(d) SOS響應(yīng)和mazEF系統(tǒng)基因的表達(dá)模式。

3和8 μg/L CIP暴露使藍(lán)藻細(xì)胞執(zhí)行不同的程序性死亡模式。3 μg/L CIP暴露下，藍(lán)藻細(xì)胞執(zhí)行AL-RCD，主要表現(xiàn)為：PS外翻和膜通透化水平的同步升高（圖 3a）、高水平的Caspase-3酶活性（1.7倍左右）和dsDNA斷裂水平（2.0倍左右）（圖 3b），以及持續(xù)的DNA降解（圖 2b）。此外，3 μg/L CIP暴露下的細(xì)胞在形貌上表現(xiàn)出縮小、起皺的形態(tài)（圖 3c）�；�因表達(dá)水平變化上，3 μg/L CIP暴露下藍(lán)藻細(xì)胞的SOS響應(yīng)得到上調(diào)，而mazEF系統(tǒng)的基因表達(dá)沒有顯著變化（圖 3d）。

多處證據(jù)表明8 μg/L CIP暴露下銅綠微囊藻細(xì)胞執(zhí)行mazEF-RCD。在這些細(xì)胞中，膜通透化水平的時(shí)間變化顯著快于PS外翻水平的時(shí)間變化（圖 3a）；同時(shí)，8 μg/L CIP暴露下細(xì)胞在形貌上表現(xiàn)出膜穿孔的形態(tài)（圖 3c）�；�因表達(dá)水平變化上，8 μg/L CIP暴露下藍(lán)藻細(xì)胞的SOS響應(yīng)顯著下調(diào)，而mazEF系統(tǒng)中負(fù)責(zé)編碼毒素蛋白的基因顯著上調(diào)（圖 3d）。

環(huán)境濃度CIP造成的不同碳氮代謝調(diào)控模式

圖4：環(huán)境濃度CIP脅迫下藍(lán)藻(a) 關(guān)鍵光合蛋白編碼基因和(b) 核心碳氮代謝路徑的變化。

3 μg/L CIP暴露對PSII的損傷并沒有對PSI末端鐵氧還蛋白的合成造成顯著的影響（圖 4a），因而并沒有對Calvin-Benson循環(huán)及其與糖酵解/糖異生的銜接產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制（圖4b）。同時(shí)，C₃H₄O₃和乙酰輔酶A合成的上調(diào)保證了三羧酸循環(huán)的進(jìn)行。在三羧酸循環(huán)中，α-酮戊二酸的合成上調(diào)，這保證了碳氮代謝的有效銜接（圖 4b）。除此之外，未受顯著影響的鐵氧還蛋白合成保證了谷氨酸鹽-谷氨酰胺循環(huán)以及尿素循環(huán)的進(jìn)行，并促進(jìn)脯氨酸分解代謝（圖4b），為AL-RCD的執(zhí)行提供ATP并激活Caspase-3酶的活性（圖 3b）。

8 μg/L CIP暴露對PSI的額外損傷使得鐵氧還蛋白合成顯著下調(diào)，造成Calvin-Benson循環(huán)，糖酵解/糖異生以及三羧酸循環(huán)過程的顯著下調(diào)，導(dǎo)致藍(lán)藻細(xì)胞碳代謝過程的崩潰（圖4b）。除此之外，鐵氧還蛋白合成下調(diào)同樣造成藍(lán)藻細(xì)胞氮代謝的下調(diào)，具體表現(xiàn)為HNO3鹽攝取和還原的下調(diào)，精氨酸的分解，谷氨酰胺向谷氨酸鹽的轉(zhuǎn)化以及脯氨酸的積累（圖4b）�？偟膩碚f，8 μg/L CIP暴露造成藍(lán)藻細(xì)胞的碳和精氨酸饑餓，這激活了mazEF-RCD的執(zhí)行。

環(huán)境意義

圖5：未來抗生素生態(tài)毒理研究和管理的工作框架。

長期以來，藍(lán)藻一直被作為評估水環(huán)境中抗生素生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的敏感篩查工具，該過程通過計(jì)算EC₅₀和風(fēng)險(xiǎn)熵值來比較和評價(jià)抗生素的風(fēng)險(xiǎn)。然而，藍(lán)藻的緩慢生長使得EC₅₀的計(jì)算需要7天以上的暴露時(shí)間。本研究中，藍(lán)藻細(xì)胞的裂解從暴露后的第3天開始。此外，EC₅₀值的計(jì)算取決于抗生素種類。在我們的工作中，給出CIP的EC₅₀值很困難，因?yàn)槲覀冇^察到不同CIP濃度暴露下幾乎一致的細(xì)胞生長抑制和裂解（圖 2a）水平。因此，在本研究中，EC₅₀值的計(jì)算不是一項(xiàng)可靠的評價(jià)指標(biāo)。

為了規(guī)避細(xì)胞生長抑制作為毒性終點(diǎn)的潛在問題，研究者通過測量光量子產(chǎn)率來快速評估抗生素的毒性。然而，對于3 μg/L CIP，我們在暴露后的第1天已經(jīng)觀察到PSII電子傳遞速率的下降（50%左右）（圖 1b）；然而此時(shí)我們并沒有檢測到Y(II)的顯著下降（圖 1a）。此外，僅評估該參數(shù)忽略了不同環(huán)境濃度暴露下CIP對不同光合蛋白損傷的差異性極其毒性的異質(zhì)性。因此，本研究建議開發(fā)一種更靈敏的技術(shù)來詳細(xì)評估和預(yù)測抗生素在光合生物中的毒性。具體來說，未來的工作應(yīng)該側(cè)重于化合物-蛋白質(zhì)的相互作用及其對藍(lán)藻生理的影響，并嘗試開發(fā)機(jī)器學(xué)習(xí)來預(yù)測抗生素的毒性（圖 5）：

i) 通過基因表達(dá)變化、光量子產(chǎn)率和光合電子傳遞速率測量以及分子對接等綜合手段來識別抗生素與光合蛋白之間的相互作用。需要重點(diǎn)研究在增加抗生素暴露水平時(shí)是否存在多個光合靶標(biāo)。
ii) 需要通過對藍(lán)藻細(xì)胞能量/毒素代謝進(jìn)行生化/組學(xué)分析來研究和比較不同抗生素暴露水平下細(xì)胞的生理反應(yīng)。
iii) 收集和整理上述數(shù)據(jù)用于訓(xùn)練機(jī)器學(xué)習(xí)。在輸入光合蛋白和抗生素的結(jié)構(gòu)以及抗生素劑量等信息后，該機(jī)器學(xué)習(xí)程序能夠預(yù)測靶標(biāo)光合蛋白、細(xì)胞的生長速率或 RCD，以及不同暴露水平下的藍(lán)藻毒素風(fēng)險(xiǎn)。

小結(jié)
在本研究中，我們揭示了環(huán)境濃度CIP與銅綠微囊藻細(xì)胞中PSII和PSI反應(yīng)中心蛋白的濃度依賴性結(jié)合。3 μg/L CIP與PSII D1蛋白結(jié)合，而8 μg/L CIP同時(shí)與 PSII D1和PSI Fe-S簇中心蛋白結(jié)合。這導(dǎo)致下游碳氮代謝的差異化調(diào)節(jié)。在大多數(shù)研究中，這種和光合蛋白的差異化結(jié)合無法通過光量子產(chǎn)率的測量來識別。碳氮代謝的差異化調(diào)節(jié)影響了藍(lán)藻細(xì)胞對DNA損傷的響應(yīng)，最終導(dǎo)致3和8 μg/L CIP暴露下藍(lán)藻細(xì)胞分別執(zhí)行AL-RCD和mazEF-RCD。伴隨細(xì)胞死亡，MC-LR的被動釋放水平（AL-RCD細(xì)胞）和單細(xì)胞合成能力（mazEF-RCD細(xì)胞）增強(qiáng)，表明單一抗生素脅迫下MC-LR風(fēng)險(xiǎn)水平的差異�？偟膩碚f，我們的研究闡明了抗生素-光合蛋白結(jié)合、碳氮代謝調(diào)節(jié)以及多樣化藍(lán)藻RCD模式之間的關(guān)系。

然而，需要更多的研究工作來使得這些結(jié)果更具有普適性，包括對不同作用模式的抗生素以及在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上與銅綠微囊藻不同的其他藍(lán)藻物種的研究。此外，有必要探究抗生素重復(fù)暴露對藍(lán)藻光合系統(tǒng)損傷的復(fù)雜性。

盡管本研究存在上述不足，但未來水生環(huán)境中抗生素的研究和管理應(yīng)側(cè)重于但不限于以下三個方面：i) 應(yīng)針對抗生素對光合生物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行更全面的評估，包括高于傳統(tǒng)毒理效應(yīng)閾值的致死效應(yīng)；ii) 有必要對抗生素毒理效應(yīng)的異質(zhì)性開展細(xì)致的研究；iii) 識別化合物-蛋白質(zhì)相互作用對于解釋多樣的毒理效應(yīng)以及評估/預(yù)測抗生素風(fēng)險(xiǎn)是不可或缺的。

本研究得到了國家自然科學(xué)基金委和深圳市科創(chuàng)委的資助。

作者簡介

通訊作者：陶益， 清華大學(xué)深圳國際研究生院環(huán)境與生態(tài)研究院副教授, 深圳市生態(tài)修復(fù)與固碳增匯重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任，Water Cycle和水生態(tài)學(xué)雜志等期刊編委。面向國家重大需求，持續(xù)攻堅(jiān)藻類水華防控理論與技術(shù)及藻菌協(xié)同減污降碳技術(shù)。針對我國水體藍(lán)藻水華監(jiān)測預(yù)警與預(yù)防性控制的難題，帶領(lǐng)課題組深入滇池、太湖以及深圳典型供水水庫開展藻類、嗅味長期監(jiān)測，開發(fā)高靈敏度、智能化藻類生長監(jiān)測與暴發(fā)預(yù)警技術(shù)，開發(fā)出紫外線-H2O2聯(lián)用抑藻、植物源化感物質(zhì)緩釋控藻、高通量陶瓷膜過濾撈藻、強(qiáng)化常規(guī)工藝去除產(chǎn)嗅藻類等適用于不同藻類和生長階段的成套技術(shù)。針對雙碳戰(zhàn)略生物固碳重大需求，發(fā)明了微藻兩階段培養(yǎng)固碳與高價(jià)產(chǎn)物合成技術(shù)，以及藻菌顆粒減污降碳及其固定化技術(shù)。曾獲得國家自然科學(xué)基金、國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃等項(xiàng)目資助。曾在Water Res., Environ. Sci. Ecotechnol.,J. Hazard. Mater.和Bioresource Technol.等環(huán)境領(lǐng)域知名期刊發(fā)表論文，獲批發(fā)明專利5項(xiàng)。

通訊郵箱：tao.yi@sz.tsinghua.edu.cn

作者： 朱寅杰，清華大學(xué)深圳國際研究生院在讀博士研究生，主要研究環(huán)境脅迫下有害水華藍(lán)藻的生理調(diào)控以及調(diào)節(jié)性死亡模式。在國際高水平學(xué)術(shù)期刊 Water Res., Environ. Sci. Ecotechnol., J. Hazard. Mater. 和 Environ. Pollut. 等發(fā)表數(shù)篇論文。

聯(lián)系郵箱：zhu-yj24@mails.tsinghua.edu.cn

姚詩詩，清華大學(xué)深圳國際研究生院2020級碩士研究生，主要研究新污染物生態(tài)毒性風(fēng)險(xiǎn)。
 

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YZQ-201A藻類光合儀，是我公司“自主研發(fā)”的藻類生理的系列產(chǎn)品之一。該儀器特色是恒溫控制、光譜可以調(diào)節(jié)、光強(qiáng)可以調(diào)節(jié)，控溫精度達(dá)到±0.1℃。光譜分為暖白、R、G、B四種光譜可選，也可以多光譜定制。搭載新的熒光氧傳感器（光學(xué)測量原理）測量微動態(tài)氧變化，自帶攪拌功能使得測量更加穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以是相同溫度，不同光強(qiáng)，還可以是不同溫度，同一光強(qiáng)對比測量均可實(shí)現(xiàn)。在恒溫恒光環(huán)境下可連續(xù)監(jiān)測藻類、根系、微生物、葉綠體等樣本的微動態(tài)氧的變化，從而計(jì)算光合速率變化的狀況。

功能與特點(diǎn)
1. 熒光氧電極（光學(xué)原理）的優(yōu)勢在于反應(yīng)速度快，穩(wěn)定性好，重復(fù)性好；對比極譜（CLARK）氧電極（電化學(xué)原理），不需要每次測量前要標(biāo)定，不需要更換溶氧膜，不需要更換電解液，不需要打磨電極，不需要活化復(fù)新電極。
2. 恒定溫度、不同光質(zhì)、不同光強(qiáng)下樣本光合速率的變化測量。
3. 不同溫度梯度下的同一樣本光合速率的變化測量
4. 自帶攪拌使得測量數(shù)據(jù)更穩(wěn)定。
5. 自帶控制軟件可進(jìn)行實(shí)時(shí)控制。

應(yīng)用
（1）藻類光合生理生態(tài)的研究
（2）微生物、根、花粉等呼吸速率的研究
（3）葉綠體等高等植物光合速率的研究

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