構(gòu)建攜帶外源基因的重組農(nóng)桿菌菌株,優(yōu)化菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)溫度等關(guān)鍵參數(shù)。在黑暗、28℃條件下,用 OD600 值 0.5 - 0.8 的農(nóng)桿菌菌液侵染棉花幼胚或下胚軸切段 10 - 20 分鐘,隨后共培養(yǎng) 2 - 3 天。期間,農(nóng)桿菌將外源基因整合至棉花細(xì)胞基因組,宛如 “基因快遞員” 精準(zhǔn)投遞。多次重復(fù)發(fā)現(xiàn),此條件下轉(zhuǎn)化效率較常規(guī)顯著提升,細(xì)胞創(chuàng)傷小、基因整合穩(wěn)定,為后續(xù)再生奠基。
精細(xì)制備金粉或鎢粉包裹外源基因的微粒 “子彈”,調(diào)節(jié)基因槍氣壓、射程、轟擊次數(shù)。對(duì)棉花愈傷組織以 1100 - 1300 psi 氣壓、9 - 12 cm 射程、單次轟擊含 0.5 - 1 μg 外源 DNA 微粒,間隔 12 - 24 小時(shí)二次轟擊。高速微粒瞬間穿透細(xì)胞壁,外源基因隨機(jī)插入基因組,似 “霰彈射擊” 廣撒基因網(wǎng)。實(shí)驗(yàn)證明,該法不受宿主基因型限制,對(duì)難轉(zhuǎn)化品種開(kāi)辟蹊徑,拓寬基因?qū)脒吔纭?/div>
四、轉(zhuǎn)基因植株再生體系構(gòu)建
(一)愈傷組織誘導(dǎo)
將導(dǎo)入基因后的棉花外植體置于高濕、弱光、恒溫 25 - 28℃環(huán)境下的初代培養(yǎng)基。7 - 10 天,外植體切口處細(xì)胞膨大、分裂,形成淡黃色疏松愈傷組織,宛如新生 “胚胎”。期間密切監(jiān)控激素濃度波動(dòng)、防污染,保障愈傷健康 “孕育”,此階段是植株再生起始,決定后續(xù)走向。
(二)愈傷組織增殖與篩選
轉(zhuǎn)移初代愈傷至含篩選抗生素的繼代培養(yǎng)基,適配光照強(qiáng)度 1500 - 2000 Lux、16 小時(shí)光照周期。每 14 - 20 天繼代一次,抗性子代愈傷增殖,非轉(zhuǎn)化組織白化、凋亡,經(jīng) 3 - 5 代 “優(yōu)勝劣汰”,富集轉(zhuǎn)基因愈傷。恰似 “大浪淘沙”,篩選出基因穩(wěn)定整合、活力旺盛的愈傷 “精英”,為分化蓄勢(shì)。
(三)植株分化與生根
把篩選后愈傷轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基,調(diào)控溫度 26 - 28℃、濕度 70% - 80%,20 - 30 天芽點(diǎn)萌動(dòng)、伸長(zhǎng);再移至生根培養(yǎng)基,10 - 15 天幼根鉆出。從芽到根,全程微調(diào)營(yíng)養(yǎng)、激素配比,呵護(hù)植株成型,宛如匠心雕琢藝術(shù)品。最終,完整轉(zhuǎn)基因棉花植株亭亭玉立,承載改良希望。
五、轉(zhuǎn)基因植株鑒定
(一)分子檢測(cè)
提取轉(zhuǎn)基因植株 DNA,PCR 擴(kuò)增外源基因片段,電泳呈現(xiàn)特異條帶則初證基因整合;再以 Southern blot 精準(zhǔn)定位基因拷貝數(shù),確保單拷貝或低拷貝插入,規(guī)避多拷貝引發(fā)的基因沉默風(fēng)險(xiǎn),從分子層面鎖定外源基因 “行蹤”,夯實(shí)植株轉(zhuǎn)基因身份。
(二)表型鑒定
田間栽植轉(zhuǎn)基因株系,與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ毡葘?duì)抗病、蟲(chóng),測(cè)纖維品質(zhì)、產(chǎn)量。多年多點(diǎn)試驗(yàn),詳實(shí)記錄生長(zhǎng)周期各階段數(shù)據(jù)。如含 Bt 基因株系遭蟲(chóng)害率驟降 70% - 80%,纖維長(zhǎng)度、強(qiáng)度依 GhMYB 基因表達(dá)上調(diào)顯著優(yōu)化,直觀展現(xiàn)轉(zhuǎn)基因優(yōu)勢(shì),驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)成效落地,為產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化鋪就坦途。
六、結(jié)論與展望
本研究系統(tǒng)性攻克棉花外源基因?qū)肱c轉(zhuǎn)基因植株再生難題,創(chuàng)新方法、精細(xì)流程,產(chǎn)出穩(wěn)定遺傳、性狀卓越的轉(zhuǎn)基因植株,為棉花育種注入強(qiáng)大活力。未來(lái),持續(xù)深化基因編輯技術(shù)融合,靶向修飾棉花基因組,有望進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)化精準(zhǔn)度、拓展性狀改良維度;同時(shí),強(qiáng)化轉(zhuǎn)基因棉花生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,完善法規(guī)監(jiān)管,力促科技與產(chǎn)業(yè)、生態(tài)協(xié)同發(fā)展,讓轉(zhuǎn)基因棉花在全球田野綻放新綠,織就農(nóng)業(yè)錦繡未來(lái)。