傳統(tǒng)的病理診斷方法在腫瘤研究中一直占據(jù)著重要地位，但隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，其局限性也日益凸顯。傳統(tǒng)的病理診斷主要基于對H&E染色組織的二維觀察，它的觀察區(qū)域相對狹窄，并且只能提供平面的二維圖像，難以全面觀察組織結(jié)構(gòu)，特別是對于大病理標(biāo)本，可能會遺漏一些病變。

為了克服傳統(tǒng)方法的局限性，科研人員一直在尋求能夠獲取組織三維圖像的有效方法。其中，連續(xù)切片成像技術(shù)是早期的嘗試之一。早在20世紀(jì)60年代末和70年代，就有相關(guān)研究將大體圖像與相應(yīng)6-8μm厚度的組織切片進(jìn)行匹配。如今，通過對連續(xù)切片組織進(jìn)行計算機(jī)處理成像，可以生成重建的3D圖像，從而能夠觀察到活檢標(biāo)本中諸如乳腺癌等病變的三維結(jié)構(gòu)。然而，這種基于切片的方法由于組織切片不可避免的不連續(xù)性，無法實現(xiàn)對組織結(jié)構(gòu)的完美連續(xù)觀察。盡管它能夠呈現(xiàn)病變的大致結(jié)構(gòu)，如腫瘤體積、腫瘤結(jié)節(jié)分支以及腫瘤內(nèi)部是否存在腔隙等，但要獲得這樣的重建3D圖像，需要數(shù)百張來自連續(xù)切片組織的玻片，這無疑是一個成本高昂且勞動密集的過程。

組織透明化技術(shù)在近年來取得了顯著進(jìn)展�；�于的方法三類，這些技術(shù)大致可分為疏水試劑、親水試劑和水凝膠，它們各自具有不同的特點。其核心原理是通過化學(xué)或物理的方法使組織或器官透明，以便光線能夠穿透深層組織，從而利用共聚焦熒光顯微鏡、多光子熒光顯微鏡和光片熒光顯微鏡等各種光學(xué)顯微鏡獲取體積圖像。在一些病理研究中，組織透明化和3D成像技術(shù)已經(jīng)展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。例如，在糖尿病小鼠的整個胰腺3D圖像中，能夠定量評估胰島的體積和數(shù)量；在人類自閉癥患者中，可以量化由神經(jīng)突形成的異常梯形結(jié)構(gòu)；在阿爾茨海默病的小鼠模型和人類患者的大腦中，還能夠?qū)?beta;-淀粉樣斑塊的分布、結(jié)構(gòu)、異質(zhì)性以及與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管的空間關(guān)系進(jìn)行定量分析。

此外，其他研究小組也在正常和患者來源的組織中展示了3D觀察的優(yōu)勢，并對其與石蠟包埋或H&E染色的兼容性進(jìn)行了測試。盡管這些技術(shù)具有潛在的應(yīng)用價值，但在實際應(yīng)用中，它們大多僅應(yīng)用于少量的病理樣本，尚未有研究能夠全面證明它們對臨床病理檢查的靈敏度和特異性有實質(zhì)性的改善作用。

整體組織透明成像技術(shù)對組織的處理效果
1、組織透明化
整體組織透明成像作為一種親水的組織透明化和3D成像技術(shù)，展現(xiàn)出了出色的性能。在對各種人體器官進(jìn)行測試時，研究人員發(fā)現(xiàn)它對人肺和淋巴結(jié)組織的透明化效果尤為顯著，其效率可與小鼠器官相媲美。具體來說，從甲醛固定的人體大腦、心臟、肺、肝、腎、脾、腸和淋巴結(jié)中切取2-5mm厚的組織塊，按照既定的整體組織透明成像處理協(xié)議進(jìn)行操作。結(jié)果顯示，肺和淋巴結(jié)組織在經(jīng)過整體組織透明成像處理后，變得高度透明，且在釋放整體組織透明成像試劑后，通過PBS清洗，可以順利地進(jìn)行石蠟包埋、切片和H&E染色。對染色后的切片進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)整體組織透明成像處理對組織造成的損傷極小，如果有的話，也可以忽略不計。這表明整體組織透明成像技術(shù)應(yīng)用于病理標(biāo)本時，不會對后續(xù)的H&E染色產(chǎn)生不利影響，而H&E染色在醫(yī)院的常規(guī)病理診斷中是必不可少的。

此外，整體組織透明成像處理還能夠保留一些診斷標(biāo)志物的抗原性，如在肺和淋巴結(jié)組織中的細(xì)胞角蛋白、α-SMA、CD68、CD79a和CD3等。這意味著病理學(xué)家在組織經(jīng)過整體組織透明成像處理后，仍然可以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以實現(xiàn)更準(zhǔn)確的診斷。這一結(jié)果與之前對整體組織透明成像處理的小鼠乳腺腺組織的研究結(jié)果一致。對于其他器官，如腦、心、肝、腎、脾和腸等，雖然整體組織透明成像試劑對它們的透明化效果不如肺和淋巴結(jié)，但經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過脫蠟處理后的石蠟包埋組織可以用于整體組織透明成像處理。這為在更多類型的組織中應(yīng)用整體組織透明成像技術(shù)提供了可能。

2、3D成像
整體組織透明成像技術(shù)不僅在組織透明化方面表現(xiàn)出色，在3D成像上也取得了重大突破。在對正常組織的研究中，以人肺組織為例，研究人員首先按照整體組織透明成像處理協(xié)議對組織塊進(jìn)行處理，然后使用抗α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）抗體進(jìn)行免疫染色，并使用細(xì)胞可滲透的綠色熒光核酸染料SYTO16對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。通過共聚焦顯微鏡和光片熒光顯微鏡對處理和染色后的肺組織樣本進(jìn)行成像。結(jié)果顯示，共聚焦顯微鏡獲得的重建3D圖像成功地可視化了包括支氣管分支網(wǎng)絡(luò)、血管系統(tǒng)和間質(zhì)纖維在內(nèi)的詳細(xì)3D組織結(jié)構(gòu)。通過免疫組織化學(xué)染色的抗α-SMA抗體，還能夠選擇性地標(biāo)記穿過間質(zhì)空間的血管網(wǎng)絡(luò)。而且，當(dāng)組織經(jīng)過整體組織透明成像處理后，能夠觀察到至少400μm深的肺組織結(jié)構(gòu)，而在未進(jìn)行組織透明化處理時，最大只能檢測到150μm深處的零散熒光信號。

同時，共聚焦顯微鏡的tile掃描工具還能夠在相同分辨率下對更大面積的組織進(jìn)行成像。除了肺組織，研究人員還對其他人體組織，如淋巴結(jié)和心臟冠狀動脈進(jìn)行了類似的處理、染色和成像操作。通過光片熒光顯微鏡獲得的重建3D圖像展示了各個組織的宏觀解剖特征，如肺組織中的肺泡、支氣管和血管網(wǎng)絡(luò)，淋巴結(jié)中的淋巴濾泡以及心臟冠狀動脈的外周分支。此外，通過鬼筆環(huán)肽進(jìn)行的肌動蛋白染色，還能夠幫助選擇性地標(biāo)記人腦皮層表面的小動脈，并在重建3D圖像中清晰地顯示出來。這些結(jié)果充分證明了整體組織透明成像技術(shù)在正常組織3D成像中的有效性和廣泛適用性。

在對病理組織的研究中，整體組織透明成像技術(shù)同樣展現(xiàn)出了強(qiáng)大的功能。例如，在對肺淀粉樣變性患者的組織研究中，為了可視化血管壁上的淀粉樣蛋白沉積，將患者在常規(guī)病理診斷后剩余的肺組織塊進(jìn)行整體組織透明成像處理和整體剛果紅染色。剛果紅染色在常規(guī)病理診斷中常用于淀粉樣蛋白染色，與H&E染色配合使用。

研究發(fā)現(xiàn)，即使在經(jīng)過整體組織透明成像處理后，剛果紅染色仍然能夠有效地發(fā)揮作用，組織塊中的淀粉樣蛋白沉積在標(biāo)本中宏觀可見。通過共聚焦顯微鏡或光片熒光顯微鏡對處理和染色后的樣本進(jìn)行3D成像，能夠清晰地看到血管壁上的管狀淀粉樣蛋白沉積。使用硫黃素T染色也能夠獲得類似的圖像。這表明整體組織透明成像技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對病理標(biāo)本的3D成像，為病理診斷提供更直觀、更詳細(xì)的信息。

在腫瘤病理診斷中的應(yīng)用
1、細(xì)胞異型性分析
對于腫瘤病理診斷來說，準(zhǔn)確分析細(xì)胞的異型性是至關(guān)重要的。研究人員以石蠟包埋的惡性淋巴瘤組織為對象，展示了整體組織透明成像技術(shù)在這方面的應(yīng)用價值。惡性淋巴瘤是一種起源于淋巴組織的腫瘤，在組織病理學(xué)上具有異常的形態(tài)特征，如組織結(jié)構(gòu)紊亂（結(jié)構(gòu)異型性）、細(xì)胞核形態(tài)改變（核異型性）以及惡性細(xì)胞的大小和形狀的多變性（多形性）。由于淋巴瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)較少，因此核異型性和多形性在惡性淋巴瘤的診斷中尤為重要。為了測試這些特征是否能夠通過3D成像進(jìn)行觀察和量化，研究人員從石蠟包埋的組織塊中使用直徑為4mm的活檢打孔器取出組織，以盡量減少組織的損失。然后對取出的組織進(jìn)行整體組織透明成像處理、成像和分析。

通過光片熒光顯微鏡獲得重建3D圖像和代表性的二維光學(xué)切片圖像，發(fā)現(xiàn)惡性淋巴瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出彌漫性浸潤模式，這反映了其結(jié)構(gòu)異型性。同時，在淋巴瘤標(biāo)本中，通過鬼筆環(huán)肽染色的浸潤性成纖維細(xì)胞的肌動蛋白纖維在局部可見，這有助于評估淋巴瘤細(xì)胞侵襲所導(dǎo)致的纖維化程度。在經(jīng)過整體組織透明成像處理后的常規(guī)H&E染色切片圖像與這些組織病理學(xué)特征一致。

此外，通過共聚焦顯微鏡獲得的更高分辨率的圖像能夠更精確地顯示細(xì)胞的核酸形態(tài)，與正常淋巴細(xì)胞相比，淋巴瘤細(xì)胞顯示出核異型性和多形性，其細(xì)胞核形狀和大小更加不均勻。通過對堆疊圖像進(jìn)行統(tǒng)計分析，進(jìn)一步證實了淋巴瘤細(xì)胞在核形狀上的異常，如核尺寸增加、核圓形度降低（核異型性）以及這些參數(shù)的更大方差（核多形性）。這些結(jié)果表明，整體組織透明成像技術(shù)可以應(yīng)用于臨床標(biāo)本石蠟包埋檔案中的3D病理檢查，為腫瘤細(xì)胞異型性的分析提供了一種新的有效方法。

2、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移篩查
腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素，因此準(zhǔn)確檢測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況對于腫瘤的治療和診斷至關(guān)重要。在本研究中，研究人員采用了基于整體組織透明成像的篩查方法對結(jié)直腸癌手術(shù)中的淋巴結(jié)進(jìn)行檢測，展示了整體組織透明成像技術(shù)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移篩查中的優(yōu)勢。在實驗中，研究人員使用了來自結(jié)直腸癌手術(shù)患者的淋巴結(jié)樣本，這些患者至少有一個淋巴結(jié)通過常規(guī)診斷方法被診斷為轉(zhuǎn)移陽性（>pT1）。將甲醛固定的淋巴結(jié)切成兩半，一半按照常規(guī)病理診斷方法進(jìn)行石蠟包埋、切片和H&E染色，并在最大切面上進(jìn)行組織學(xué)評估；另一半則進(jìn)行整體組織透明成像篩查，即先進(jìn)行整體組織透明成像處理，然后使用Alexa Fluor 647-共軛的抗細(xì)胞角蛋白抗體進(jìn)行免疫染色，最后通過光片熒光顯微鏡進(jìn)行成像，并對可疑信號進(jìn)行基于切片的組織學(xué)評估，以獲得最終診斷。

在對74個淋巴結(jié)的檢測中，研究人員通過整體組織透明成像這種篩查方法，發(fā)現(xiàn)有4個淋巴結(jié)僅通過整體組織透明成像被新診斷為陽性轉(zhuǎn)移。通過與常規(guī)病理診斷方法對比，計算出常規(guī)診斷方法的靈敏度為85.2%（23/27），有4個假陰性。而整體組織透明成像將靈敏度提高到了100%（考慮到篩查中的假陰性已通過深切片排除）。這表明整體組織透明成像能夠提高檢測轉(zhuǎn)移癌結(jié)節(jié)的靈敏度，為腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的診斷提供了更準(zhǔn)確的方法。

研究結(jié)果
整體組織透明成像技術(shù)可以成功地應(yīng)用于臨床病理診斷過程中。它不僅能夠?qū)κ�蠟包埋組織進(jìn)行有效的處理和3D成像，而且在處理過程中不會損害組織的抗原性，不會影響后續(xù)的常規(guī)病理檢查，如H&E染色。這使得整體組織透明成像技術(shù)能夠與傳統(tǒng)的病理方法兼容，為在臨床實踐中廣泛應(yīng)用提供了可能。

在腫瘤病理診斷中，整體組織透明成像技術(shù)展現(xiàn)出了獨特的優(yōu)勢。通過對惡性淋巴瘤組織的研究，它能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞的異型性進(jìn)行量化分析，為腫瘤的診斷提供了更客觀、更準(zhǔn)確的依據(jù)。同時，在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移篩查方面，整體組織透明成像能夠提高檢測的靈敏度，有助于更早地發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移情況，從而為患者的治療提供更及時、更有效的指導(dǎo)。

整體組織透明成像技術(shù)的應(yīng)用有助于回顧性和前瞻性臨床病理診斷。在回顧性診斷方面，它能夠?qū)κ�蠟包埋的病理組織進(jìn)行重新評估，挖掘出更多關(guān)于腫瘤細(xì)胞異型性等方面的信息。在前瞻性診斷中，它能夠提高對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等關(guān)鍵病理特征的檢測靈敏度，為腫瘤的早期診斷和治療提供支持�？傮w而言，整體組織透明成像技術(shù)能夠提高臨床病理診斷的客觀性、定量性和敏感性。它為病理學(xué)家提供了一種全新的工具，能夠更全面、更深入地了解腫瘤組織的結(jié)構(gòu)和特性，從而做出更準(zhǔn)確的診斷。

展望未來
盡管整體組織透明成像技術(shù)取得了顯著的成果，但仍然存在一些需要進(jìn)一步改進(jìn)和研究的方向。 在染色方法方面，雖然目前整體組織透明成像技術(shù)與多種抗體和染色劑兼容，但在染色效率和效果上還有提升空間。特別是對于3D組織中染色劑、抗體或探針的有效滲透，目前只有少數(shù)關(guān)鍵參數(shù)被確定。未來需要建立一種簡單而強(qiáng)大的基于擴(kuò)散滲透的染色方法，或者進(jìn)一步識別基于小分子的染色試劑，如短肽和核酸（如適體），以提高染色效果和效率。

在組織透明化效率方面，雖然整體組織透明成像試劑對肺和淋巴結(jié)組織的透明化效果較好，但對于其他器官，如腦、心、肝、腎等，還需要進(jìn)一步提高其透明化效率。這可能需要對整體組織透明成像試劑進(jìn)行優(yōu)化升級，或者尋找更有效的組織透明化和脫色化學(xué)試劑。

此外，對于一些含有內(nèi)源性色素的組織，如含有黑色素的組織，目前還沒有有效的處理方法，這也是未來需要解決的問題。 總之，整體組織透明成像技術(shù)為腫瘤病理成像帶來了新的突破和希望。隨著未來研究的不斷深入和技術(shù)的不斷完善，相信它將在腫瘤病理診斷領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用，為人類健康事業(yè)做出更大的貢獻(xiàn)。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：Satoshi Nojima,Etsuo A. Susaki, Kyotaro Yoshida, Hiroyoshi Takemoto,Naoto Tsujimura, Shohei Iijima, Ko Takachi, Yujiro Nakahara, Shinichiro Tahara, Kenji Ohshima, Masako Kurashige, Yumiko Hori, Naoki Wada, Jun-ichiro Ikeda, Atsushi Kumanogoh, Eiichi Morii & Hiroki R. Ueda;CUBIC pathology: three-dimensional imaging for pathological diagnosis;2017 Aug 24;7(1):9269. doi: 10.1038/s41598-017-09117-0.