細(xì)胞名稱： HuH-7(人肝癌細(xì)胞)
細(xì)胞別稱： HuH-7；HUH-7；HuH7；Huh7；HUH7；JTC-39；JapaneseTissueCulture-39
細(xì)胞貨號(hào)： SNL-085
生長(zhǎng)特性： 貼壁
培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境： 37℃；5% CO2；飽和濕度
細(xì)胞簡(jiǎn)介： HuH-7細(xì)胞來自患有肝癌的57歲日本男性肝臟，據(jù)報(bào)道可產(chǎn)甲胎蛋白、胰酶α抗體、血漿銅藍(lán)蛋白、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白等。
HuH-7細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
 

• 細(xì)胞有觸角/偽足

HuH-7細(xì)胞有多個(gè)觸角/偽足，屬于細(xì)胞自身特性，為正�，F(xiàn)象。  

• 培養(yǎng)時(shí)存在黑點(diǎn)

HuH-7細(xì)胞中有黑色顆粒，為細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)囊泡或其他胞內(nèi)物質(zhì)，屬于細(xì)胞自身特性。背景中也有少量黑色顆粒，為細(xì)胞碎片。少量碎片不影響細(xì)胞生長(zhǎng)，若碎片較多，可以吸走培養(yǎng)基后用預(yù)熱的PBS輕輕潤(rùn)洗1-2遍。
 

• 控制接種密度

HuH-7細(xì)胞接種密度過低時(shí)生長(zhǎng)速度緩慢。推薦傳代比例1：2-1：3，參考傳代周期3-4天。（注意T25培養(yǎng)瓶底面積為25cm2，10cm培養(yǎng)皿底面積是55cm2。一個(gè)T25傳兩個(gè)10cm皿約等于1：4傳代，而非1：2）。
 

• 控制消化時(shí)間

HuH-7消化難度中等，使用0.25%胰酶（含EDTA）放37度培養(yǎng)箱消化，參考消化時(shí)間3-4min。因不同實(shí)驗(yàn)室使用的胰酶品牌不同，需根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整時(shí)間。實(shí)際操作中，消化到細(xì)胞部分自然滑落時(shí)再終止消化。變圓但未脫落時(shí)需要繼續(xù)消化，確保細(xì)胞是被胰酶消化下來而不是被強(qiáng)行吹下的，避免細(xì)胞損傷。
 
HuH-7細(xì)胞傳代攻略

• 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基、胰酶、PBS、離心管、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）
• 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞10-20s，吸走潤(rùn)洗的PBS；
• T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化；
• 消化到細(xì)胞明顯回縮，間隙變大，但未完全脫落時(shí)加2-3mL完全培養(yǎng)基終止胰酶消化；
• 混勻細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心3min；
• 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基；（T25推薦10mL，T75推薦20mL）
• 離心完成后，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣；

 
Tips：
l 如果您無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時(shí)間，建議按照下述操作：加入胰酶后，放入37度培養(yǎng)箱消化，然后每隔1min拿出觀察，傾斜培養(yǎng)瓶，若細(xì)胞部分滑落，說明可以終止消化，否則再放回培養(yǎng)箱消化1min重復(fù)操作。
 
HuH-7細(xì)胞凍存攻略

• 配制程序性凍存液，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記。
• 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀；
• 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中；
• 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
• 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置。

Tips：

• 推薦凍存液配方92% FBS + 8%DMSO或92%完全培養(yǎng)基+8%DMSO

• 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長(zhǎng)期保存。
• 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用，若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。
• T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通�？蓛龃�1-2管，10cm皿長(zhǎng)滿通�？蓛龃�2-3管。
• 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。
• 沒有程序凍存盒的實(shí)驗(yàn)室，加入細(xì)胞后可以將凍存管放在泡沫盒中（不用泡沫盒細(xì)胞復(fù)蘇活率低）4度靜置5-10min，再-20度靜置2h后轉(zhuǎn)入-80度過夜，第二天轉(zhuǎn)入液氮保存。

 
HuH-7細(xì)胞復(fù)蘇攻略

• 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速；
• 將細(xì)胞從液氮罐中取出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化完全融化或米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過程不超過2min；
• 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異
• 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
• 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips：

• 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房。
• 凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完全蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù)，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。
• 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染。
• 水浴后觀察還有較大冰塊時(shí)要繼續(xù)水浴直到融化
• 整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成。

 
HuH-7細(xì)胞收貨攻略

• 常溫細(xì)胞

• 收貨后，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2h以上；
• 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL在原瓶，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片，觀察細(xì)胞密度，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首次傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于80%，擰松瓶蓋，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
• 發(fā)貨T25瓶中灌裝的是與細(xì)胞配套的完全培養(yǎng)基，上一步吸出的培養(yǎng)基（約75mL）轉(zhuǎn)移至50mL離心管1500rpm離心5min，取上清保存于4度冰箱，用于培養(yǎng)細(xì)胞，以平穩(wěn)過渡到客戶自己的培養(yǎng)基。

 

• 凍存細(xì)胞

• 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存，若干冰完全揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決；
• 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
• 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；

Tips：

• 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損、干冰完全揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員；
• 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；

 
常見問題及解決方案
NO.1細(xì)胞密度怎么計(jì)算的？
嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式；
 
NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可通過換液去除，因此每2天正常換液即可，換液前培養(yǎng)基充分預(yù)熱。
 
NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久？
每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的，不能完全規(guī)定消化時(shí)間，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn)。