原位雜交檢測組織 MicroRNA 新進(jìn)展
一、引言
（一）探針設(shè)計革新
- MicroRNA（miRNA）作為一類內(nèi)源性非編碼小 RNA，在基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)里扮演關(guān)鍵角色，深度參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等眾多生理進(jìn)程，其異常表達(dá)與腫瘤、神經(jīng)退行性疾病等多種病癥緊密相連。
- 原位雜交（ISH）技術(shù)能于組織細(xì)胞原位精準(zhǔn)呈現(xiàn)特定核酸序列分布與表達(dá)，對 miRNA 研究意義非凡。傳統(tǒng) ISH 檢測 miRNA 面臨靈敏度欠佳、特異性不足、分辨率有限等難題，極大限制 miRNA 組織學(xué)研究深度與廣度，催生對檢測技術(shù)革新的迫切需求。
（一）探針設(shè)計革新
- 結(jié)構(gòu)優(yōu)化：以往探針多為線性，新設(shè)計融入莖環(huán)、發(fā)夾等結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)與 miRNA 互補(bǔ)結(jié)合穩(wěn)定性。例如，設(shè)計特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針，堿基配對區(qū)域經(jīng)精心計算，使雜交體熱穩(wěn)定性提升約 15℃，降低非特異性結(jié)合風(fēng)險，保障檢測專一性。
- 修飾基團(tuán)引入：末端修飾熒光、生物素等基團(tuán)，熒光基團(tuán)從普通熒光素升級為量子點(diǎn)，光穩(wěn)定性提高 3 倍，亮度增強(qiáng) 50%，實(shí)現(xiàn)低豐度 miRNA 可視化；生物素修飾便于后續(xù)鏈霉親和素信號放大，放大倍數(shù)達(dá) 10 - 20 倍，讓微弱信號精準(zhǔn)捕捉。
- 組織固定改良：摒棄傳統(tǒng)甲醛長時間固定致 miRNA 流失與交聯(lián)過度弊端，采用溫和交聯(lián)劑戊二醛短時間固定（從常規(guī) 24 小時縮至 4 小時），結(jié)合冷凍保護(hù)劑蔗糖梯度滲透，維持組織形態(tài)同時最大程度保留 miRNA，樣本完整性提升約 30%。
- 通透化處理升級：運(yùn)用組合酶（如蛋白酶 K 與 RNA 酶 H 協(xié)同），精準(zhǔn)調(diào)控酶解程度，細(xì)胞膜穿孔更均勻適度，既促進(jìn)探針高效進(jìn)入，又防止細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損壞，細(xì)胞內(nèi)探針可達(dá)性提高 40%，利于精準(zhǔn)定位 miRNA。
- 信號放大策略：基于滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）結(jié)合分支 DNA（bDNA）技術(shù)創(chuàng)新。RCA 使探針結(jié)合位點(diǎn)成環(huán)滾動復(fù)制，局部 DNA 拷貝數(shù)激增；bDNA 再搭建多層級信號放大架構(gòu)，二者聯(lián)用信號強(qiáng)度相較傳統(tǒng)直接熒光標(biāo)記放大 50 - 100 倍，微弱 miRNA 信號清晰呈現(xiàn)。
- 多模態(tài)成像融合：整合熒光成像高分辨率與放射性核素成像高靈敏度優(yōu)勢，采用雙模態(tài)探針，如熒光基團(tuán)與放射性同位素標(biāo)記同一探針，借助特殊成像設(shè)備同步采集，定位精度達(dá)亞細(xì)胞水平，實(shí)現(xiàn) miRNA 表達(dá)全方位剖析，減少假陽性與假陰性結(jié)果。
- 樣本準(zhǔn)備：新鮮組織迅速取材，經(jīng)改良戊二醛固定、蔗糖梯度脫水后冷凍切片，厚約 10 - 15μm，貼片于氨基硅烷處理載玻片，防脫片且利探針結(jié)合；細(xì)胞樣本則經(jīng)溫和胰酶消化、低速離心收集后涂片固定。
- 雜交反應(yīng)：優(yōu)化緩沖液（含甲酰胺精準(zhǔn)濃度調(diào)控、適量鮭魚精 DNA 封閉非特異位點(diǎn)）中加入新型探針，37℃孵育 2 - 4 小時（依樣本與探針特性微調(diào)），嚴(yán)謹(jǐn)洗滌去除未結(jié)合探針，確保特異雜交信號。
- 信號檢測與分析：熒光樣本用共聚焦顯微鏡多通道掃描，采集不同深度圖像重建 3D 模型；放射性核素樣本由專用成像儀采集，軟件量化信號強(qiáng)度與分布；多模態(tài)數(shù)據(jù)經(jīng)算法融合分析，結(jié)合免疫組化標(biāo)記細(xì)胞類型標(biāo)志物，精準(zhǔn)關(guān)聯(lián) miRNA 與特定細(xì)胞群體表達(dá)特征。
- 疾病診斷精準(zhǔn)化：在腫瘤病理診斷中，可原位甄別癌組織 miRNA 異常表達(dá)亞型，較傳統(tǒng)方法早 2 - 3 個月精準(zhǔn)判斷腫瘤侵襲性與轉(zhuǎn)移潛能，指導(dǎo)個性化治療方案擬定，提高 5 年生存率約 15% - 20%。
- 發(fā)育機(jī)制深度解析：胚胎發(fā)育研究里，追蹤 miRNA 時空表達(dá)動態(tài)，揭示神經(jīng)、心臟等器官發(fā)育關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點(diǎn)，填補(bǔ)傳統(tǒng)基因表達(dá)譜空白，助力干細(xì)胞分化誘導(dǎo)策略優(yōu)化，加速再生醫(yī)學(xué)進(jìn)展。
- 藥物研發(fā)新靶點(diǎn)挖掘：為神經(jīng)退行性疾病藥物篩選鎖定 miRNA 新靶點(diǎn)，經(jīng)原位檢測評估藥物對靶 miRNA 及下游通路影響，縮短新藥研發(fā)周期約 1 - 2 年，降低成本 30% - 40%，推動靶向治療創(chuàng)新突破。
標(biāo)簽：
分子雜交儀、原位雜交儀、紫外交聯(lián)儀
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