摘要：人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因電轉(zhuǎn)染大鼠前軟骨干細(xì)胞（PSCs）的效果及其對(duì)細(xì)胞增殖、分化等特性的影響。通過(guò)構(gòu)建特定的電轉(zhuǎn)染體系，將 hTERT 基因?qū)氪笫?PSCs，利用多種檢測(cè)手段分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在分子、細(xì)胞及功能層面的變化，為相關(guān)組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)參考。
一、引言
前軟骨干細(xì)胞在骨骼發(fā)育與修復(fù)過(guò)程中具有重要作用，其增殖與分化能力影響著骨組織的形成與再生。然而，在體外培養(yǎng)及應(yīng)用過(guò)程中，細(xì)胞往往面臨增殖能力受限、老化等問(wèn)題。人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因與細(xì)胞的端粒維持及增殖能力密切相關(guān)。將 hTERT 基因?qū)氪笫笄败浌歉杉?xì)胞，有望改善細(xì)胞的增殖特性，并進(jìn)一步探索其對(duì)分化能力的潛在調(diào)控作用，這對(duì)于骨組織工程領(lǐng)域中種子細(xì)胞的優(yōu)化具有重要意義。
二、材料與方法
（一）實(shí)驗(yàn)材料
- 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取健康的新生大鼠，用于分離前軟骨干細(xì)胞。
- 主要試劑：包括用于細(xì)胞培養(yǎng)的高糖 DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶等；構(gòu)建 hTERT 基因表達(dá)載體所需的質(zhì)粒提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、連接酶等；電轉(zhuǎn)染試劑以及用于檢測(cè)細(xì)胞增殖、分化相關(guān)指標(biāo)的抗體、試劑盒等。
（二）大鼠前軟骨干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
- 細(xì)胞分離：在無(wú)菌條件下，取新生大鼠的長(zhǎng)骨組織，去除骨膜及周圍軟組織。將骨組織剪成小塊，置于含有適量消化酶的溶液中，在 37°C 下振蕩消化一定時(shí)間。消化完成后，通過(guò)離心收集細(xì)胞沉淀，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中。
- 細(xì)胞培養(yǎng)：將接種后的細(xì)胞置于 37°C、5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到一定比例時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第 2 - 3 代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
（三）hTERT 基因表達(dá)載體的構(gòu)建
- 根據(jù) hTERT 基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過(guò) PCR 技術(shù)擴(kuò)增目的基因片段。
- 將擴(kuò)增得到的 hTERT 基因片段與合適的載體質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理，然后利用連接酶將兩者連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。
- 將構(gòu)建好的重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，通過(guò)篩選、鑒定獲得陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行純度與濃度檢測(cè)。
（四）電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)
- 細(xì)胞準(zhǔn)備：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠前軟骨干細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用預(yù)冷的電轉(zhuǎn)染緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至合適濃度。
- 電轉(zhuǎn)染體系構(gòu)建：將一定量的重組 hTERT 基因質(zhì)粒與細(xì)胞懸液混合均勻，加入到電轉(zhuǎn)染杯中，設(shè)置合適的電轉(zhuǎn)染參數(shù)，如電壓、電容、脈沖時(shí)間等。
- 電轉(zhuǎn)染操作：將電轉(zhuǎn)染杯置于電轉(zhuǎn)儀中進(jìn)行電脈沖處理，處理完成后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
（五）轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的檢測(cè)與分析
- 基因表達(dá)檢測(cè)：采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT - PCR）技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中 hTERT 基因的 mRNA 表達(dá)水平，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對(duì)照，分析基因轉(zhuǎn)染效率。
- 端粒酶活性檢測(cè)：利用端粒酶活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的端粒酶活性變化，通過(guò)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)比，評(píng)估 hTERT 基因?qū)Χ肆Ｃ富钚缘挠绊憽?/li>
- 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：采用 CCK - 8 法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的增殖情況，繪制細(xì)胞增殖曲線，觀察 hTERT 基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠前軟骨干細(xì)胞增殖能力的改變。
- 細(xì)胞分化能力檢測(cè)：在特定的誘導(dǎo)分化條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)成骨分化相關(guān)標(biāo)志物（如堿性磷酸酶活性、骨鈣素表達(dá)等）以及成軟骨分化相關(guān)標(biāo)志物（如 Aggrecan、Col2a1 表達(dá)等），分析 hTERT 基因轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞分化能力的影響。
三、結(jié)果
（一）hTERT 基因表達(dá)載體的鑒定
經(jīng)過(guò)酶切鑒定與測(cè)序分析，證實(shí)成功構(gòu)建了 hTERT 基因重組表達(dá)載體，其序列與預(yù)期一致，可用于后續(xù)電轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。
（二）電轉(zhuǎn)染效率及基因表達(dá)檢測(cè)
qRT - PCR 結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中 hTERT 基因的 mRNA 表達(dá)水平顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表明電轉(zhuǎn)染成功將 hTERT 基因?qū)氪笫笄败浌歉杉?xì)胞，且具有較高的轉(zhuǎn)染效率。
（三）端粒酶活性變化
端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染 hTERT 基因后的大鼠前軟骨干細(xì)胞端粒酶活性明顯增強(qiáng)，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比具有顯著差異，說(shuō)明導(dǎo)入的 hTERT 基因有效激活了細(xì)胞的端粒酶活性。
（四）細(xì)胞增殖能力
CCK - 8 法檢測(cè)的細(xì)胞增殖曲線顯示，轉(zhuǎn)染 hTERT 基因的大鼠前軟骨干細(xì)胞增殖速度明顯加快，在培養(yǎng)后期仍能保持較高的增殖活性，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖逐漸減緩并趨于穩(wěn)定，表明 hTERT 基因轉(zhuǎn)染顯著提高了細(xì)胞的增殖能力。
（五）細(xì)胞分化能力
在成骨分化誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)染 hTERT 基因的細(xì)胞堿性磷酸酶活性及骨鈣素表達(dá)在一定時(shí)間內(nèi)與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無(wú)明顯差異，但隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的成骨分化相關(guān)指標(biāo)有升高趨勢(shì)；在成軟骨分化誘導(dǎo)條件下，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 Aggrecan 和 Col2a1 表達(dá)水平與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，在早期變化不顯著，后期有一定程度的增加，提示 hTERT 基因轉(zhuǎn)染對(duì)大鼠前軟骨干細(xì)胞的分化能力可能存在一定的延遲性影響。
四、討論
本研究成功地將人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因電轉(zhuǎn)染大鼠前軟骨干細(xì)胞，通過(guò)一系列檢測(cè)手段證實(shí)了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在基因表達(dá)、端粒酶活性、增殖能力等方面發(fā)生了顯著變化。在細(xì)胞分化能力方面，雖然早期影響不明顯，但后期出現(xiàn)的相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)變化表明 hTERT 基因可能在細(xì)胞分化進(jìn)程中發(fā)揮著潛在的調(diào)控作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。
電轉(zhuǎn)染技術(shù)作為一種高效的基因?qū)敕椒ǎ诒緦?shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出較好的效果，但在操作過(guò)程中，電轉(zhuǎn)染參數(shù)的優(yōu)化對(duì)于提高轉(zhuǎn)染效率和減少細(xì)胞損傷至關(guān)重要。此外，本研究為進(jìn)一步探索 hTERT 基因修飾的前軟骨干細(xì)胞在骨組織工程中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，例如在構(gòu)建組織工程骨時(shí)，利用轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可能提高種子細(xì)胞的數(shù)量與活性，從而促進(jìn)骨組織的再生與修復(fù)。然而，在將其應(yīng)用于臨床實(shí)踐之前，還需要對(duì)細(xì)胞的安全性、免疫原性等多方面進(jìn)行全面評(píng)估，以確保其在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的有效性與可行性。
綜上所述，本研究的成果為骨組織工程領(lǐng)域中前軟骨干細(xì)胞的基因修飾研究提供了有價(jià)值的參考，有望推動(dòng)相關(guān)領(lǐng)域在細(xì)胞治療與組織再生方面取得進(jìn)一步的發(fā)展。
