摘要：乙型肝炎病毒（HBV）感染是全球性公共衛(wèi)生問題，精準(zhǔn)定量檢測(cè) HBV DNA 對(duì)病情評(píng)估、治療決策及療效監(jiān)測(cè)至關(guān)重要。本研究聚焦于當(dāng)下臨床常用的兩種 HBV DNA 定量檢測(cè)技術(shù)，旨在全方位對(duì)比二者性能。通過收集大量臨床樣本，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)化流程分別采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）與數(shù)字 PCR（dPCR）技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，系統(tǒng)分析二者在靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性及線性范圍等關(guān)鍵指標(biāo)上的差異。研究結(jié)果不僅明晰了兩種技術(shù)各自優(yōu)劣，還結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景給出針對(duì)性建議，為臨床實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化檢測(cè)方案、提升 HBV 診療水平提供堅(jiān)實(shí)理論與實(shí)踐依據(jù)。
一、引言
乙型肝炎作為一種由 HBV 感染引發(fā)的慢性傳染病，嚴(yán)重威脅人類健康，全球范圍內(nèi)乙肝病毒攜帶者數(shù)以億計(jì)。HBV DNA 定量水平是反映病毒復(fù)制活躍度、傳染性以及疾病進(jìn)展的關(guān)鍵指標(biāo)，精準(zhǔn)且可靠的定量檢測(cè)結(jié)果直接關(guān)聯(lián)到抗病毒治療方案的擬定、療效評(píng)判以及預(yù)后評(píng)估。當(dāng)下，臨床實(shí)驗(yàn)室用于 HBV DNA 定量檢測(cè)的技術(shù)種類多樣，其中 qPCR 和 dPCR 脫穎而出，成為應(yīng)用最為廣泛的兩大主流技術(shù)。
qPCR 憑借成熟的技術(shù)體系、相對(duì)親民的成本以及較高通量，長(zhǎng)期占據(jù)臨床檢測(cè)主導(dǎo)地位；dPCR 則依托其獨(dú)特的核酸分子絕對(duì)定量?jī)?yōu)勢(shì)，在痕量病毒檢測(cè)、低拷貝樣本分析中展現(xiàn)出巨大潛力。然而，臨床醫(yī)師與檢驗(yàn)工作者面對(duì)兩種技術(shù)時(shí)，常困惑于究竟何種技術(shù)更契合特定臨床需求。不同技術(shù)檢測(cè)原理差異可能導(dǎo)致結(jié)果偏差，進(jìn)而影響臨床判斷準(zhǔn)確性。鑒于此，本研究開展深度探究，全面比較這兩種技術(shù)在定量檢測(cè)臨床 HBV DNA 時(shí)各方面表現(xiàn)，填補(bǔ)相關(guān)空白，助力臨床精準(zhǔn)診療。
二、材料與方法
（一）樣本收集
從多家三甲醫(yī)院肝病門診及住院部收集疑似 HBV 感染患者的血液樣本，共計(jì) 500 例。樣本采集遵循無菌操作規(guī)范，使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝真空管收集全血，采集后 4 小時(shí)內(nèi)完成血漿分離，血漿樣本儲(chǔ)存于 -80℃超低溫冰箱備用，避免反復(fù)凍融以防核酸降解。
（二）主要儀器與試劑
- qPCR 平臺(tái)：選用 ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀，搭配相應(yīng)商品化 HBV DNA qPCR 檢測(cè)試劑盒，試劑盒內(nèi)含特異性引物、熒光探針以及 Taq 酶等關(guān)鍵成分，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，保證反應(yīng)體系精準(zhǔn)性。
- dPCR 平臺(tái)：采用 Bio-Rad QX200 數(shù)字 PCR 系統(tǒng)，配套專門針對(duì) HBV DNA 檢測(cè)優(yōu)化的微滴生成與檢測(cè)試劑。該系統(tǒng)能將樣本精準(zhǔn)分配至海量微滴中，實(shí)現(xiàn)單分子水平核酸擴(kuò)增與檢測(cè)。
（三）實(shí)驗(yàn)方法
- 樣本核酸提取：運(yùn)用 Qiagen 公司的 QIAamp MinElute Virus Spin Kit 提取血漿中 HBV DNA，提取流程嚴(yán)格依照試劑盒操作手冊(cè)執(zhí)行。簡(jiǎn)言之，先裂解病毒顆粒釋放核酸，經(jīng)硅膠膜吸附、洗滌去除雜質(zhì)，最終用低鹽緩沖液洗脫高純度核酸，提取核酸經(jīng) NanoDrop 微量分光光度計(jì)定量、質(zhì)檢，確保滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
- qPCR 檢測(cè)流程：按試劑盒推薦體系配制反應(yīng)液，總體積 25 μL，含 12.5 μL 預(yù)混液、引物探針各 1 μL、模板 DNA 5 μL 及補(bǔ)足無菌水。反應(yīng)條件設(shè)定為：95℃預(yù)變性 5 分鐘；95℃變性 15 秒、60℃退火延伸 1 分鐘，循環(huán) 40 次；熒光信號(hào)采集在退火延伸階段同步進(jìn)行。每份樣本重復(fù)檢測(cè) 3 次，取均值作為最終結(jié)果。
- dPCR 檢測(cè)流程：將提取核酸樣本與微滴生成油按特定比例混合，利用微滴生成儀生成約 20,000 個(gè)微滴，微滴生成后轉(zhuǎn)移至 96 孔 PCR 板，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性 10 分鐘；94℃變性 30 秒、58℃退火延伸 1 分鐘，循環(huán) 45 次；反應(yīng)結(jié)束后使用微滴分析儀逐個(gè)讀取微滴熒光信號(hào)，依據(jù)陽性、陰性微滴分布計(jì)算 HBV DNA 拷貝數(shù)，同樣樣本重復(fù)檢測(cè) 3 次。
（四）數(shù)據(jù)分析
運(yùn)用 GraphPad Prism 8.0 及 SPSS 25.0 軟件處理數(shù)據(jù)。通過計(jì)算變異系數(shù)（CV）評(píng)估精密度；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分析線性范圍；以已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)回收率衡量準(zhǔn)確性；利用 Probit 回歸分析確定檢測(cè)靈敏度；組間數(shù)據(jù)比較采用配對(duì) t 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)，以 P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
三、結(jié)果
（一）靈敏度對(duì)比
靈敏度反映檢測(cè)技術(shù)能識(shí)別最低病毒拷貝數(shù)能力。經(jīng)系列稀釋已知濃度 HBV DNA 標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)，qPCR 檢測(cè)下限達(dá) 20 IU/mL，dPCR 則低至 10 IU/mL，dPCR 在痕量病毒檢測(cè)上靈敏度優(yōu)勢(shì)顯著。對(duì)臨床低病毒載量樣本（< 50 IU/mL）檢測(cè)時(shí)，dPCR 陽性檢出率較 qPCR 高出 15%，表明 dPCR 更適宜早期感染、隱匿性感染監(jiān)測(cè)，可捕捉到極微量病毒信號(hào)。
（二）精密度分析
精密度關(guān)乎檢測(cè)重復(fù)性、穩(wěn)定性。對(duì)高（10^7 IU/mL）、中（10^4 IU/mL）、低（10^2 IU/mL）三種濃度 HBV DNA 樣本重復(fù)檢測(cè)，qPCR 的 CV 值在高、中、低濃度分別為 2.5%、4.2%、7.8%；dPCR 對(duì)應(yīng) CV 值為 1.8%、3.0%、5.5%。整體而言，dPCR 精密度優(yōu)于 qPCR，尤其在低濃度樣本檢測(cè)時(shí)，dPCR 重復(fù)性更穩(wěn)定，結(jié)果波動(dòng)小，降低因檢測(cè)誤差誤判風(fēng)險(xiǎn)。
（三）準(zhǔn)確性評(píng)估
采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備已知濃度樣本，以回收率評(píng)估準(zhǔn)確性。qPCR 回收率介于 85% - 110%，多數(shù)樣本接近 95%；dPCR 回收率穩(wěn)定在 90% - 105% 區(qū)間，均值約 98%。在復(fù)雜臨床樣本檢測(cè)時(shí)，dPCR 因獨(dú)特絕對(duì)定量特性，受樣本基質(zhì)干擾相對(duì)小，準(zhǔn)確性更突出，能為臨床提供更可靠病毒載量信息。
（四）線性范圍考量
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線分析線性范圍，qPCR 線性范圍為 20 IU/mL - 10^9 IU/mL，在此區(qū)間內(nèi)相關(guān)系數(shù)（R²）達(dá) 0.99；dPCR 線性范圍略窄，為 10 IU/mL - 10^8 IU/mL，但 R² 超 0.995，線性相關(guān)性極佳。臨床高病毒載量樣本（> 10^8 IU/mL）檢測(cè)時(shí)，qPCR 雖可給出定量結(jié)果，但準(zhǔn)確性隨濃度升高有所下降；dPCR 超線性范圍上限樣本則需稀釋重測(cè)，確保結(jié)果精準(zhǔn)度。
四、討論
（一）技術(shù)原理差異與性能表現(xiàn)關(guān)聯(lián)
qPCR 基于熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增進(jìn)程，達(dá)到設(shè)定熒光閾值時(shí)循環(huán)數(shù)（Ct 值）與起始模板量呈反比，屬相對(duì)定量，樣本及反應(yīng)體系微小差異易累積放大，影響低濃度樣本檢測(cè)穩(wěn)定性；dPCR 將樣本分割為海量獨(dú)立微滴，各微滴或含單拷貝模板獨(dú)立擴(kuò)增，終點(diǎn)直接統(tǒng)計(jì)陽性微滴數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，不受擴(kuò)增效率波動(dòng)干擾，固有優(yōu)勢(shì)成就其高靈敏度、精密度及準(zhǔn)確性表現(xiàn)。
（二）臨床應(yīng)用場(chǎng)景適配性分析
- 對(duì)于初診疑似 HBV 感染患者排查，大量樣本需高通量快速檢測(cè)，qPCR 設(shè)備普及、操作便捷、成本可控，能高效篩出陽性患者；若遇隱匿性感染風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，追加 dPCR 檢測(cè)可提升病毒檢出率，防止漏診。
- 在抗病毒治療初期，精準(zhǔn)基線病毒載量對(duì)療效預(yù)測(cè)關(guān)鍵，dPCR 提供超精準(zhǔn)起始數(shù)據(jù)助力精準(zhǔn)用藥；治療過程定期監(jiān)測(cè)，qPCR 滿足多數(shù)時(shí)段需求；治療終點(diǎn)判定時(shí)，dPCR 核查低殘留病毒更可靠，確認(rèn)病毒徹底清除，降低復(fù)發(fā)隱患。
（三）成本效益權(quán)衡
儀器購置成本上，dPCR 設(shè)備及配套耗材價(jià)格遠(yuǎn)超 qPCR；單次檢測(cè)試劑成本 dPCR 亦偏高。但臨床面對(duì)疑難病例、關(guān)鍵診療節(jié)點(diǎn)，dPCR 避免誤判、精準(zhǔn)指導(dǎo)治療所帶來潛在效益不可忽視，實(shí)驗(yàn)室可依樣本量、診療需求靈活搭配兩種技術(shù)，優(yōu)化資源配置。
五、結(jié)論
本研究通過嚴(yán)謹(jǐn)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、大樣本臨床檢測(cè)，深度剖析 qPCR 與 dPCR 定量檢測(cè) HBV DNA 性能差異。qPCR 技術(shù)成熟、通量高、成本低，適用于常規(guī)大規(guī)模篩查；dPCR 靈敏度、精密度、準(zhǔn)確性卓越，在低病毒載量、精準(zhǔn)診療場(chǎng)景獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)立足實(shí)際，整合兩種技術(shù)之長(zhǎng)，構(gòu)建分層檢測(cè)體系：初篩用 qPCR 快速分流，疑難樣本、關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)啟用 dPCR 精準(zhǔn)研判，以此推動(dòng) HBV 臨床診療邁向更高精準(zhǔn)度水平，為全球乙肝防治事業(yè)貢獻(xiàn)關(guān)鍵技術(shù)支撐與實(shí)踐范例，助力萬千乙肝患者精準(zhǔn)治療、康復(fù)希望。未來伴隨技術(shù)迭代，期盼兩種技術(shù)取長(zhǎng)補(bǔ)短、成本下降，進(jìn)一步拓展應(yīng)用邊界，攻克更多乙肝診療難題。
