摘要：隨著全球人口增長(zhǎng)與糧食需求攀升，以及環(huán)境變化帶來(lái)的諸多挑戰(zhàn)，培育優(yōu)良性狀的水稻品種迫在眉睫。轉(zhuǎn)基因技術(shù)為實(shí)現(xiàn)水稻高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)等多元目標(biāo)開(kāi)辟嶄新路徑。本研究聚焦電注射法這一新興基因?qū)�入手段，深入探究其用于獲取轉(zhuǎn)基因水稻植株的可行性與實(shí)操細(xì)節(jié)。通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)流程，精準(zhǔn)把控電注射參數(shù)，對(duì)水稻愈傷組織實(shí)施外源基因?qū)�入操作，歷經(jīng)組織培養(yǎng)、篩選鑒定等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，成功獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的轉(zhuǎn)基因水稻植株。研究全面剖析電注射法各環(huán)節(jié)影響因素，為水稻基因工程提供高效、可靠的技術(shù)方案，助力未來(lái)水稻遺傳改良工作穩(wěn)健前行。

水稻作為全球半數(shù)以上人口的主食，其產(chǎn)量與品質(zhì)直接關(guān)乎糧食安全及民生大計(jì)。傳統(tǒng)水稻育種手段歷經(jīng)數(shù)代更迭，為糧食增產(chǎn)貢獻(xiàn)卓著，但漸顯瓶頸，難以迅速滿足當(dāng)下復(fù)雜多變的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求，諸如應(yīng)對(duì)頻發(fā)極端氣候、新型病蟲(chóng)害肆虐，以及消費(fèi)者對(duì)稻米營(yíng)養(yǎng)口感愈發(fā)嚴(yán)苛訴求等。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，憑借精準(zhǔn)定向改造水稻基因組成，有望打破自然遺傳壁壘，快速整合優(yōu)良性狀。當(dāng)下，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、基因槍轟擊等是主流轉(zhuǎn)基因方法，各有優(yōu)勢(shì)卻也不乏局限。農(nóng)桿菌介導(dǎo)受水稻品種基因型限制，轉(zhuǎn)化效率波動(dòng)大；基因槍成本高昂，設(shè)備維護(hù)繁雜，易致基因片段多拷貝插入，影響植株遺傳穩(wěn)定性。

電注射法在動(dòng)物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染領(lǐng)域成績(jī)斐然，具操作簡(jiǎn)易、設(shè)備親民、基因?qū)�入精�?zhǔn)可控等特性，近年引發(fā)植物基因工程領(lǐng)域廣泛關(guān)注。理論上，借助適宜電脈沖，可在細(xì)胞膜瞬時(shí)造孔，促使外源基因順暢穿越質(zhì)膜屏障，融入植物細(xì)胞基因組。水稻細(xì)胞結(jié)構(gòu)獨(dú)特、細(xì)胞壁厚實(shí)堅(jiān)韌，為電注射技術(shù)實(shí)操增添挑戰(zhàn)，然一旦攻克難題，有望為水稻轉(zhuǎn)基因研究注入全新活力，開(kāi)辟高效轉(zhuǎn)化捷徑。

經(jīng)潮霉素抗性篩選，初始電注射處理愈傷組織塊約 300 份，首輪篩選存活愈傷僅 45 塊，存活率約 15%，表明電注射結(jié)合潮霉素篩選能有效甄別轉(zhuǎn)化與非轉(zhuǎn)化細(xì)胞，但轉(zhuǎn)化效率尚待提升；存活愈傷組織質(zhì)地、色澤不均，部分邊緣褐化，經(jīng)繼代培養(yǎng)優(yōu)化，多數(shù)褐化組織恢復(fù)活力，增殖至適宜分化規(guī)模，共獲 32 塊生長(zhǎng)旺盛、狀態(tài)穩(wěn)定的抗性愈傷用于后續(xù)再生培養(yǎng)。

抗性愈傷組織在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng) 3 - 4 周漸現(xiàn)綠芽點(diǎn)，芽誘導(dǎo)率達(dá) 68.75%（22/32）；芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基 2 周后，根系茁壯發(fā)育，生根率 86.36%（19/22），成功再生完整植株 19 株。轉(zhuǎn)基因水稻幼苗相較野生型，葉片寬厚、色澤濃綠，根系發(fā)達(dá)、根毛密集，初步暗示外源 TsVP 基因可能正向影響植株生長(zhǎng)發(fā)育，強(qiáng)化營(yíng)養(yǎng)吸收與物質(zhì)合成。

對(duì) T₁代轉(zhuǎn)基因與野生型水稻幼苗設(shè) 0 mM、100 mM、150 mM、200 mM NaCl 脅迫處理 14 天，野生型幼苗 100 mM NaCl 處理即現(xiàn)嚴(yán)重鹽害，葉片枯黃、生長(zhǎng)停滯、根系腐爛；轉(zhuǎn)基因植株 150 mM NaCl 才顯輕微鹽害，葉尖微黃、生長(zhǎng)稍緩，200 mM NaCl 處理下多數(shù)仍維持一定生長(zhǎng)勢(shì)，存活率超 60%，較野生型（< 10%）優(yōu)勢(shì)顯著；生理指標(biāo)檢測(cè)顯示，鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株葉片脯氨酸、可溶性糖含量大幅提升，細(xì)胞膜損傷率顯著降低，協(xié)同佐證 TsVP 基因賦予水稻卓越耐鹽性，高效維持細(xì)胞滲透平衡、減輕膜損傷。

本研究成功借電注射法收獲轉(zhuǎn)基因水稻，彰顯其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。與農(nóng)桿菌介導(dǎo)比，電注射不受水稻品種基因型制約，實(shí)驗(yàn)選用粳稻品種轉(zhuǎn)化高效，預(yù)示對(duì)秈稻及雜交稻同樣適用，拓寬水稻基因改良選材范圍；相較基因槍?zhuān)�設(shè)備購(gòu)置、耗材成本銳減超 60%，操作簡(jiǎn)便，無(wú)需復(fù)雜微彈制備與彈射裝置維護(hù)，利于普通實(shí)驗(yàn)室推廣；且精準(zhǔn)電脈沖參數(shù)調(diào)控，降低多拷貝基因插入風(fēng)險(xiǎn)，提升轉(zhuǎn)基因植株遺傳穩(wěn)定性，為功能基因精細(xì)研究筑牢根基。

電注射參數(shù)是成敗關(guān)鍵。電壓過(guò)高、脈沖時(shí)長(zhǎng)超閾值易致細(xì)胞膜不可逆破損、細(xì)胞死亡，使轉(zhuǎn)化效率歸零；電壓過(guò)低、脈沖過(guò)短則造孔不足，基因難以入胞。本研究經(jīng)多輪摸索，方鎖定 800 V、30 ms 最佳組合；細(xì)胞密度、緩沖液成分同等重要，細(xì)胞過(guò)密阻礙電場(chǎng)均勻分布，影響基因擴(kuò)散；緩沖液滲透壓失衡則引發(fā)細(xì)胞失水皺縮或吸水脹破。優(yōu)化后細(xì)胞密度 1 × 10⁶ 個(gè) /mL 及含 0.4 M 甘露醇、5 mM 氯化鈣緩沖液，最大程度保障細(xì)胞活性與轉(zhuǎn)化效能。

雖成果斐然，但挑戰(zhàn)猶存。當(dāng)前僅以單一基因、品種初探電注射法可行性，后續(xù)需拓展多元耐逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)基因組合轉(zhuǎn)化，適配不同水稻生態(tài)型；優(yōu)化轉(zhuǎn)化流程，融合基因編輯技術(shù)（如 CRISPR/Cas9）精準(zhǔn)敲除水稻內(nèi)源負(fù)調(diào)控基因，協(xié)同增強(qiáng)外源基因功能；深入解析轉(zhuǎn)基因植株長(zhǎng)期種植生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，從基因漂移、土壤微生物群落演變等維度全方位評(píng)估，嚴(yán)守生物安全底線，推動(dòng)轉(zhuǎn)基因水稻從實(shí)驗(yàn)室邁向田間，切實(shí)服務(wù)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

本研究開(kāi)創(chuàng)性運(yùn)用電注射法，成功將耐鹽基因 TsVP 導(dǎo)入粳稻品種，歷經(jīng)重重篩選、鑒定關(guān)卡，斬獲穩(wěn)定遺傳、耐鹽性卓越的轉(zhuǎn)基因水稻植株，證實(shí)電注射法在水稻基因工程領(lǐng)域巨大潛力。詳盡解析各實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)關(guān)鍵因素，為同行提供詳實(shí)技術(shù)參照；展望后續(xù)研究方向，旨在攻克現(xiàn)存局限，加速轉(zhuǎn)基因水稻實(shí)用化進(jìn)程，借科技之力護(hù)全球糧食安全，促水稻產(chǎn)業(yè)綠色、高效、可持續(xù)發(fā)展。