超分辨顯微成像技術(shù)自誕生以來，憑借其優(yōu)異的納米級(jí)空間分辨率，已成為生命科學(xué)研究中精準(zhǔn)揭示復(fù)雜生命現(xiàn)象的重要成像技術(shù)。

其中，基于單分子定位的超分辨成像策略，使得定位、觀察、研究單個(gè)探針分子獨(dú)特的理、化、光學(xué)性能成為可能。偏振作為熒光信號(hào)的一個(gè)重要特性，近年來伴隨著單分子三維取向成像技術(shù)的發(fā)展，逐步在單分子成像和超分辨領(lǐng)域中展示出諸多新穎且重要的應(yīng)用特性。

國(guó)家納米科學(xué)中心中國(guó)科學(xué)院納米生物效應(yīng)與安全性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的趙睿航，盧晉團(tuán)隊(duì)總結(jié)了單分子三維取向超分辨成像技術(shù)的最新進(jìn)展，介紹并分析了兩類主要的單分子三維取向熒光顯微技術(shù)——基于熒光吸收與輻射偏振調(diào)制的單分子三維取向成像方法以及利用點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)工程將單個(gè)熒光分子的三維取向信息編碼到熒光圖像上的成像策略。

超分辨熒光成像技術(shù)概述
超分辨熒光成像技術(shù)主要分為三類�；�于單分子定位的超分辨顯微（SMLM）技術(shù)分辨率高，但成像時(shí)間長(zhǎng)、時(shí)間分辨率差；結(jié)構(gòu)光照明顯微成像（SIM）技術(shù)成像速度快、光子利用率高、適用染料多，但分辨率有限；受激輻射損耗（STED）超分辨顯微技術(shù)可提升分辨率，但存在光毒性和光漂白問題。此外，還有最低光子通量（MINFLUX）超分辨成像策略，具有較高定位精度和成像分辨率。

在生物研究中，生物大分子的微觀結(jié)構(gòu)和分子間相互作用變化在取向角度域有顯著變化，單分子三維取向超分辨成像技術(shù)有助于深入闡釋生命過程機(jī)制。

單分子三維取向成像技術(shù)
一、基于熒光吸收與輻射偏振調(diào)制的方法

1、技術(shù)原理

利用熒光分子吸收與輻射過程中偏振特性，通過在激發(fā)光路加入偏振調(diào)制模塊，分析不同偏振方向激發(fā)光吸收效率及熒光發(fā)射信號(hào)偏振方向，獲取單分子三維取向信息。如單分子熒光偏振（SMFP）技術(shù)，交替用平行和垂直偏振光激發(fā)樣品，經(jīng)偏振分光棱鏡分路接收熒光信號(hào)，分析強(qiáng)度擬合取向和動(dòng)力學(xué)信息。

2、研究案例

對(duì)肌動(dòng)蛋白和S-DNA構(gòu)象研究，通過熒光偏振顯微技術(shù)測(cè)量取向變化，確定分子取向信息。

3、技術(shù)局限

線偏振激發(fā)調(diào)制要求單分子常亮且取向固定，與SMLM結(jié)合時(shí)需篩選常亮單分子，效率受限；僅對(duì)發(fā)射信號(hào)偏振分光成像雖便捷但難同時(shí)獲取多未知參數(shù)，適用于有取向分布先驗(yàn)信息的樣品。
 

二、基于PSF工程的方法

1、單分子三維取向?qū)�SMILM定位精度的影響及校正
單分子三維取向會(huì)使定位結(jié)果產(chǎn)生偏差，可通過設(shè)計(jì)“y-phi”掩模等方法消減偏差光子提升定位精度。

2、高焦成像策略
離焦成像可展示單分子取向差異，但會(huì)增加PSF尺寸、降低信噪比和定位準(zhǔn)確性；利用最大似然估計(jì)從單分子PSF圖樣獲取取向信息，但對(duì)軸向分量不敏感。

3、傅里葉面調(diào)制策略

• CHIDO方法：使用雙折射掩模編碼PSF，通過應(yīng)力工程光學(xué)器件產(chǎn)生雙折射圖案，經(jīng)四分之一波片和沃拉斯頓棱鏡分離成右旋圓（RHC）和左旋圓（LHC）PSF，可攜帶定位取向信息，對(duì)單分子三維取向和位置檢測(cè)能力強(qiáng)。

• Vortex PSF技術(shù)：在共軛后焦平面加入渦旋相位板獲得 Vortex PSF，可確定分子三維位置、取向和擺動(dòng)信息，精度高、信噪比高，形狀對(duì)極角和方位角敏感，可用于解析熒光探針與樣品相互作用。

4、基于傅里葉面調(diào)制的單分子顯微成像系統(tǒng)性策略
以傅里葉光學(xué)為理論框架，將偶極子信息編碼到單分子熒光圖像，如SMOLM技術(shù)可實(shí)現(xiàn)單分子三維取向與定位同時(shí)成像；后續(xù)研究不斷發(fā)展該技術(shù)，如利用NR對(duì)磷脂膜成像揭示其對(duì)化學(xué)成分響應(yīng)，將Vortex PSF應(yīng)用于SMOLM對(duì)雙層脂膜成像剖析生物樣品結(jié)構(gòu)特征，提出raPol顯微鏡及raMVR顯微鏡提高檢測(cè)率和精度，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種生物樣品的成像研究。

應(yīng)用于活細(xì)胞或單顆粒的超分辨取向成像技術(shù)
1、超分辨偶極取向映射（SDOM）方法
通過調(diào)制偏振激發(fā)光解析熒光偶極子取向，亞衍射極限分辨率，成像速度快，適用于活細(xì)胞成像。

2、偏振SIM（pSIM）技術(shù)
結(jié)合熒光偏振調(diào)制和結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)，可解析生物分子取向與結(jié)構(gòu)信息，與三維SIM結(jié)合實(shí)現(xiàn)快速偏振三維SIM（polar-3DSIM）成像。

3、光譜和偏振光學(xué)層析成像（SPOT）技術(shù)
從熒光強(qiáng)度、光譜和偏振三個(gè)維度解析膜信息，用于活細(xì)胞亞細(xì)胞尺度脂質(zhì)組學(xué)研究，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞活動(dòng)。

4、單分子熒光偏振顯微鏡在單顆粒催化成像中的應(yīng)用
用于納米限域效應(yīng)的單分子三維取向研究，解釋了納米催化劑上的催化活性現(xiàn)象。

總結(jié)與展望
單分子三維取向成像技術(shù)在解析生物樣品納米尺度結(jié)構(gòu)與有序度、生物大分子構(gòu)象等方面具備獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但其廣泛應(yīng)用面臨諸多挑戰(zhàn)。

在熒光標(biāo)記策略上，現(xiàn)有方式難以確保熒光探針與生物大分子取向關(guān)系，如基于不同原理的 SMOLM 技術(shù)均存在各自問題；在單分子熒光亮度或成像信噪比方面，成像策略會(huì)降低信噪比，但已有優(yōu)化篩選熒光探針提升信噪比的嘗試；活細(xì)胞成像受多種因素影響困難重重，雖可借鑒相關(guān)方案且深度學(xué)習(xí)提供新思路，但復(fù)雜微環(huán)境仍增加了解析難度；多色成像或波長(zhǎng)維度拓展是應(yīng)用于復(fù)雜生命過程研究的趨勢(shì)。

不過，隨著技術(shù)發(fā)展，該技術(shù)在提升成像精準(zhǔn)度、推進(jìn)應(yīng)用廣度和深度等方面前景依然廣闊。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：趙睿航, 盧晉. 單分子三維取向超分辨成像技術(shù)進(jìn)展（特邀）[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(6): 0618015. Ruihang Zhao, Jin Lu. Three-Dimensional Orientation and Localization Microscopy of Single Molecules Using Super-Resolution Imaging Technology (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618015.