由于衍射極限的存在，傳統(tǒng)的光學成像手段無法觀測細胞器結(jié)構(gòu)及細胞器之間的相互作用。單分子定位顯微成像技術(shù)作為三種超分辨技術(shù)中分辨率最高的成像技術(shù)，為生命科學領(lǐng)域的研究提供了重要手段。

大視場高通量單分子成像技術(shù)具有分辨率高、成像范圍大和成像時間短等特點，在生物醫(yī)學領(lǐng)域廣泛用于觀察和分析復雜的生物結(jié)構(gòu)和功能。

南方科技大學生物醫(yī)學工程系的林昭珺團隊發(fā)表文章，從基于硬件掃描的拼接成像技術(shù)、基于大面陣sCMOS的大視場高通量成像技術(shù)、大景深單分子定位成像技術(shù)、高通量數(shù)據(jù)分析技術(shù)4個方面回顧近年來大視場高通量單分子定位技術(shù)的研究進展。最后，對大視場高通量單分子定位成像技術(shù)的發(fā)展方向進行展望。

研究背景
一、傳統(tǒng)成像技術(shù)的局限與超分辨顯微成像技術(shù)的興起
傳統(tǒng)光學成像受衍射極限限制，橫向分辨率約250nm，軸向分辨率約500nm，難以觀測細胞器結(jié)構(gòu)及相互作用。電子顯微鏡雖分辨率高，但存在制樣復雜、缺乏分子特異性和無法多色成像等問題，無法用于活細胞成像。

超分辨顯微成像技術(shù)應(yīng)運而生，主要包括結(jié)構(gòu)光照明顯微成像技術(shù)（SIM）、受激發(fā)射損耗顯微成像技術(shù)（STED）和單分子定位成像技術(shù)（SMLM），其中SMLM分辨率最高，橫向可達 20-30nm，軸向可達60nm。

二、單分子定位技術(shù)原理及應(yīng)用
單分子定位技術(shù)通過讓視場范圍內(nèi)熒光分子隨機稀疏激活發(fā)光，利用定位算法擬合單分子點空間位置，多次循環(huán)采集完成定位，實現(xiàn)超分辨成像。

該技術(shù)廣泛應(yīng)用于觀測細胞骨架、膜蛋白分布和細胞器相互作用等，但傳統(tǒng)方法需采集大量原始數(shù)據(jù)，成像時間長、數(shù)據(jù)存儲和分析壓力大。

三、高通量成像的重要性及需求
高通量成像在觀察細胞形態(tài)、篩選和分析大量細胞表型等方面優(yōu)勢顯著，可在單次采集中獲取更多成像數(shù)據(jù)。

隨著單分子定位技術(shù)應(yīng)用增多，對其視場大小和吞吐量要求提高，高通量超分辨成像有助于探究不同細胞種群差異，對跨尺度成像意義重大。

基于硬件掃描的拼接成像
一、技術(shù)實現(xiàn)方式及案例
Holden等改進硬件和軟件構(gòu)建高通量PALM，將10/90分束鏡用于定制顯微鏡，90%光用于3D-PALM，采用自動閉環(huán)控制熒光團密度機制，利用805nm激光反射光自動鎖焦，對數(shù)百個活新月桿菌FtzS進行三維成像并定量分析Z-ring納米級結(jié)構(gòu)。

Mund等設(shè)計的顯微鏡在樣品上劃分區(qū)域，預定義激光強度等參數(shù)自動采集，平臺移動后有機械平衡時間，引入近紅外激光和象限光電二極管實現(xiàn)z方向鎖焦，研究內(nèi)吞過程中內(nèi)吞蛋白組織結(jié)構(gòu)。

Beghin等提出的全自動化顯微鏡平臺集成多種模塊，低倍鏡篩選后高倍鏡超分辨成像，自動鎖焦減少漂移，對96孔樣品板微管成像，三維定位和圖像重建耗時8h，平均每孔5min。

二、自動聚焦技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展
單分子定位技術(shù)長時間成像易受溫度等因素導致圖像漂移，自動聚焦技術(shù)至關(guān)重要。傳統(tǒng)自動聚焦技術(shù)分兩類，近期深度學習也用于此，如Pinkard等根據(jù)散斑信號利用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)量化離焦量，Lightley等引入額外激光和相機，通過深度學習分析反射光斑圖像實現(xiàn)自動聚焦，訓練好的模型應(yīng)用于顯微成像系統(tǒng)可快速自動對焦。

三、存在的問題
基于硬件掃描的拼接成像受位移臺精度和拼接算法影響大，對位移臺和圖像配準精度要求嚴苛，否則會產(chǎn)生偽影影響成像質(zhì)量。

相鄰子區(qū)域多次受激光照射，增加光毒性且熒光易漂白；圖像拼接時相鄰圖像可能不連續(xù)；需定制硬件設(shè)施和額外鎖焦系統(tǒng)，操作復雜、成本高；成像時間久。

基于大面陣相機的非拼接式成像
一、技術(shù)優(yōu)勢與面臨的挑戰(zhàn)
傳統(tǒng)單分子定位顯微系統(tǒng)中，傳感器面積和傳感單元數(shù)量限制了分辨能力和視場大小，二者相互制約。大面陣sCMOS傳感器的出現(xiàn)使兼顧兩者成為可能，但面臨大視場均勻照明和像差校正等挑戰(zhàn)。

二、實現(xiàn)均勻照明的多種方法
1、光束整形
Douglass等利用微透鏡陣列將高斯光束整形為平頂光束，擴大照明面積約4倍，受機械振動影響小、成本低，但場適應(yīng)性有限；還有基于pi-shaper、top-shape等元件的光束整形方法。

2、多模光纖
Zhao等利用激光光束組合器和多模光纖實現(xiàn)大視場均勻照明，保證照明功率密度；Deschamps等將多模激發(fā)與TIRF技術(shù)結(jié)合，獲得均勻熒光亮度和光學切片效果。

3、波導技術(shù)
Diekmann等提出的Waveguide-TIRF技術(shù)利用波導產(chǎn)生均勻TIRF照明，降低背景噪聲、提高信噪比和分辨率，但存在照明區(qū)域難限制、會同時照明和漂白整個樣品、波導制備與系統(tǒng)復雜等問題。

4、掃描振鏡
Mau等利用振鏡掃描高斯光束實現(xiàn)約200μm×200μm視場均勻照明，需保證掃描與曝光高度同步，增加系統(tǒng)復雜度。

5、棱鏡式照明
Foylan等提出的MesoTIRF照明方案利用棱鏡和自研發(fā)物鏡實現(xiàn)大視場TIRF照明；Rames等利用4π籠式透鏡實現(xiàn)TIRF與Hilo兩種照明模式切換，提供較高軸向分辨率。

大景深單分子定位技術(shù)
一、技術(shù)難點及解決思路
傳統(tǒng)高斯點擴散函數(shù)在焦平面前后光場分布對稱，景深和軸向光場變化幅度小，無法判斷單分子點位置，一次成像只能拍攝焦面附近單分子點。為克服此問題，研究者提出點擴散函數(shù)工程、遠聚焦等技術(shù)路線。

二、點擴散函數(shù)工程的具體方法及應(yīng)用
1、散光點擴散函數(shù)
莊小威課題組首次將散光像差引入STORM系統(tǒng)，通過插入柱面鏡調(diào)制，實現(xiàn)±600nm范圍內(nèi)三維定位，軸向分辨率約50nm，因便捷性廣泛應(yīng)用。

2、雙螺旋點擴散函數(shù)
Moerner課題組利用相位板實現(xiàn)，其形狀隨焦深變化，景深約±900nm，定位精度對軸向位置敏感度低，實現(xiàn)10-20nm軸向分辨率和約2μm景深三維成像。

3、自彎曲點擴散函數(shù)
莊小威課題組利用艾里光束設(shè)計，通過其不同焦深橫向位置定位熒光分子，實現(xiàn)3μm成像范圍內(nèi)10-15nm精確三維定位，但使用空間光調(diào)制器會降低信噪比。

4、Tetrapod點擴散函數(shù)Moerner課題組基于相位板調(diào)制出一系列，擁有最大景深可達20μm，定位精度較高，在多色成像、活細胞成像等方面有應(yīng)用，如對活芽酵母細胞染色質(zhì)動力學進行三維追蹤成像；2022年Fu等利用可變形鏡優(yōu)化，提升定位精度。

三、遠聚焦技術(shù)的原理及實例
遠聚焦成像系統(tǒng)中，前兩個物鏡將焦平面附近光場“投影”在第三個物鏡焦點處，通過移動第三個物鏡改變焦平面位置實現(xiàn)大景深成像。如Booth課題組利用可變形鏡實現(xiàn)多平面成像，Radenovic課題組將其與像差校正點擴散函數(shù)工程結(jié)合優(yōu)化后對COS-7細胞成像，Mondal課題組利用電動可調(diào)焦透鏡特性實現(xiàn)約4.5μm軸向范圍成像。

高通量數(shù)據(jù)分析

一、數(shù)據(jù)處理壓力與加速策略
sCMOS數(shù)據(jù)采集通量高，但帶來海量數(shù)據(jù)處理壓力。常用高性能GPU加速計算集群等方法，如Hu等利用Amazon EC2加速3B分析，Li等提出QC-STORM方法提高處理速度，Gui等提出HCP-STORM異構(gòu)計算平臺，速度大幅提升。

二、圖像拼接的創(chuàng)新方法及優(yōu)勢
傳統(tǒng)拼接方法基于灰度圖，Du等提出用定位表代替灰度圖的NanoStitcher方法，經(jīng)確定重疊區(qū)域、預處理、拼接、優(yōu)化路徑、融合平滑等步驟，處理后的微管圖像結(jié)構(gòu)清晰連續(xù)，在最小化文件大小和存儲無損文件方面有優(yōu)勢。

三、其他相關(guān)方法及成果
Barentine等提出采集和分析一體化的高通量納米顯微鏡，配有自動鎖焦等機制，開發(fā)壓縮算法和優(yōu)化代碼，實現(xiàn)實時定位，成像數(shù)萬個細胞只需一天。本課題組提出FD-DeepLoc方法，基于深度學習校正大視場像差，實現(xiàn)大視場全細胞超分辨成像，提升三維SMLM成像通量約100倍。

總結(jié)與展望
在工程應(yīng)用方面，目前常將多種高通量單分子成像方法相結(jié)合，例如大面陣sCMOS成像技術(shù)與點擴散函數(shù)工程以及高通量數(shù)據(jù)分析技術(shù)相互配合，以此獲得更出色的成像效果。

展望未來，為進一步提高單分子定位成像通量，可從多個方向進行優(yōu)化。在激發(fā)照明上，可把高功率激光與激發(fā)光掃描技術(shù)相結(jié)合，并采用快速閃爍染料；成像光路方面，調(diào)制系統(tǒng)點擴散函數(shù)以獲取適合大視場低采樣率的點擴散函數(shù)來提升定位精度；數(shù)據(jù)處理時，利用深度學習矯正更大視場范圍的場相關(guān)像差；系統(tǒng)設(shè)計層面，通過高密度成像配合基于深度學習的數(shù)據(jù)分析減少成像所需總幀數(shù)，從而提高成像速度及通量。

總之，該技術(shù)在成像系統(tǒng)多方面的優(yōu)化中極具研究價值與應(yīng)用潛力。
聲明：本文僅用作學術(shù)目的。文章來源于：林昭珺, 常桓梽, 李依明. 高通量單分子定位顯微成像技術(shù)進展（特邀）[J]. 激光與光電子學進展, 2024, 61(6): 0618004. Zhaojun Lin, Huanzhi Chang, Yiming Li. Advances in High-Throughput Single-Molecule Localization Microscopy (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(6): 0618004.