基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法
瀏覽次數(shù)：77 發(fā)布日期：2024-11-27
來源：威尼德生物科技
摘要
本研究聚焦于開發(fā)一種創(chuàng)新的基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法，旨在攻克傳統(tǒng)電穿孔檢測手段在精準性、實時性與定量分析層面的局限。借助精心設(shè)計的實驗體系，融合微納加工、電學(xué)測試及細胞生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建出摩擦納米電發(fā)生器驅(qū)動電穿孔并同步采集電阻抗信號的平臺。通過對多種細胞系實驗，深入剖析電阻抗頻譜特征參數(shù)與電穿孔程度的量化關(guān)聯(lián)，揭示電穿孔動態(tài)進程中膜通透性、離子流變化規(guī)律。該方法創(chuàng)新性地達成高靈敏、無損且定量監(jiān)測，為基因轉(zhuǎn)染、藥物遞送等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中電穿孔優(yōu)化提供關(guān)鍵技術(shù)支撐，有力推動跨膜運輸機制闡釋及相關(guān)生物技術(shù)革新。
一、引言
在生物醫(yī)學(xué)前沿領(lǐng)域，電穿孔技術(shù)作為一種強效操控細胞通透性、助力外源物質(zhì)跨膜運輸?shù)氖侄�，于基因治療、藥物靶向遞送等范疇扮演舉足輕重角色。傳統(tǒng)電穿孔評估多依賴顯微鏡觀測、熒光標記追蹤等，然而這些方式或受限于時空分辨率，僅捕捉特定時刻靜態(tài)畫面；或因標記流程繁雜、對細胞生理干擾大，難以精準、連續(xù)反映電穿孔動態(tài)全貌，尤其在定量解析電穿孔程度、速率及長期穩(wěn)定性等關(guān)鍵指標上力不從心。
摩擦納米發(fā)電機（TENG）的問世，以其獨特機械能 - 電能轉(zhuǎn)換效能、便攜靈活優(yōu)勢，革新微觀能量供給模式。將其與電穿孔有機融合成摩擦納米電穿孔體系，有望借摩擦起電誘發(fā)可控電脈沖驅(qū)動物質(zhì)跨膜，更開啟原位、實時監(jiān)測新路徑。電阻抗譜技術(shù)恰似微觀世界 “聽診器”，細胞電生理狀態(tài)細微異動會映射于阻抗頻譜，憑借測量細胞在多頻交流電場下阻抗變化，能無損探知膜結(jié)構(gòu)、胞內(nèi)離子濃度等隱秘信息，契合電穿孔進程精準量化訴求。本研究由此立意，深挖基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法，欲為細胞微觀操控與分析筑牢新技術(shù)基石。
二、實驗材料與方法
（一）材料準備
- 細胞系選取：精心挑選具代表性哺乳動物細胞系，涵蓋人胚腎細胞（HEK293）、乳腺癌細胞（MCF - 7）及小鼠成纖維細胞（NIH/3T3），確保實驗普適性與生物醫(yī)學(xué)關(guān)聯(lián)緊密性。上述細胞購自權(quán)威細胞庫，依規(guī)范復(fù)蘇、培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 高糖培養(yǎng)基，置于 37°C、5% CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱，定期傳代維持對數(shù)生長期活力。
- TENG 器件制備：采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）與聚四氟乙烯（PTFE）為摩擦電對材料，經(jīng)光刻、軟刻蝕微納加工，構(gòu)建出接觸分離式 TENG。PDMS 薄膜依標準配比固化于硅片模具，PTFE 經(jīng)裁切、等離子體處理調(diào)控表面功函數(shù)，二者貼合組裝，外接可精確調(diào)控負載與電學(xué)采集電路，保障穩(wěn)定摩擦起電與電脈沖輸出，輸出電壓范圍 0 - 500 V、頻率 0.1 - 10 Hz 可調(diào)。
（二）實驗平臺搭建
設(shè)計定制集摩擦納米電穿孔、電阻抗譜測量于一體多功能測試平臺（圖 1）。核心為微流控芯片，中央微腔室（100 μL 容積）以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）熱壓成型，嵌入鉑絲電極用于電穿孔脈沖施加與阻抗信號采集，兩側(cè)微通道銜接進樣、廢液池，保障細胞懸液穩(wěn)定灌流。芯片安置于高精度三維移動臺，上方懸置 TENG，借機械傳動精確調(diào)控接觸距離、壓力，確保每次摩擦起電一致性；電學(xué)端與阻抗分析儀（Keysight E4990A，頻率 100 Hz - 10 MHz）、示波器（Tektronix MDO3000）互聯(lián)，實現(xiàn)多參數(shù)同步記錄。
（三）實驗流程
- 細胞懸液準備與芯片加載：胰蛋白酶消化對數(shù)生長期細胞，重懸于電穿孔緩沖液（含 1 mM MgCl₂、10 mM HEPES、140 mM NaCl，pH 7.4），調(diào)整密度至 1×10⁶ cells/mL，微量進樣器注入芯片微腔室，靜置 15 min 使細胞貼壁附著。
- 摩擦納米電穿孔操作與阻抗測量：設(shè)置 TENG 初始參數(shù)（如 200 V 電壓、2 Hz 頻率）啟動工作，觸發(fā)電穿孔；同步阻抗分析儀以 10 mV 交流激勵，掃頻采集電穿孔進程阻抗數(shù)據(jù)，每 30 s 重復(fù)測量一輪，持續(xù) 15 min，記錄多頻點（1 kHz、10 kHz、100 kHz 等）阻抗幅值、相位信息；過程中以顯微鏡旁軸觀測細胞形態(tài)大體變化輔助驗證。
- 對照實驗設(shè)置：設(shè)未施加電穿孔 “空白對照” 組、傳統(tǒng)電穿孔儀（Bio - Rad Gene Pulser Xcell）電穿孔 “陽性對照” 組，依相似流程操作、測量，確保本方法效能評估客觀性與特異性。
三、結(jié)果與討論
（一）電阻抗譜特征變化剖析
電穿孔伊始，高頻段（1 MHz - 10 MHz）阻抗幅值驟降（圖 2），源于細胞膜電容特性主導(dǎo)，電穿孔致膜電容增大（新孔洞形成等同新增電容支路），依阻抗公式 （為角頻率、為電容），高頻阻抗銳減，反映膜結(jié)構(gòu)瞬間 “破綻”；中頻（100 kHz - 1 MHz）相位角延遲漸顯，暗示胞內(nèi)離子經(jīng)孔道外流、胞外離子內(nèi)滲，改變胞內(nèi)電導(dǎo)率，依 Cole - Cole 模型，離子遷移弛豫時間延長致相位異動；低頻段（100 Hz - 100 kHz）阻抗幅值平緩上升，歸因為胞內(nèi)大分子、細胞器受離子濃度波動影響，重新分布調(diào)整對電場響應(yīng)，整體呈現(xiàn)低頻 “電學(xué)慣性” 增強態(tài)勢。不同細胞系因膜脂質(zhì)組成、蛋白含量差異，阻抗變化幅度、速率有別，如 HEK293 高頻降阻更陡、MCF - 7 低頻升阻稍緩，契合細胞固有生理特質(zhì)。
（二）電穿孔定量關(guān)系構(gòu)建
定義 “電穿孔指數(shù)（EI）” 綜合表征電穿孔程度，經(jīng)主成分分析融合多頻阻抗特征量（幅值、相位權(quán)重因子依貢獻度分配）得 EI 量化值，與傳統(tǒng)熒光標記法測細胞攝取熒光素鈉（反映膜通透性）量值擬合（圖 3），呈顯著線性正相關(guān)（²），驗證本方法定量精準性；繪制 EI 隨時間動態(tài)曲線，各細胞系電穿孔 2 - 3 min 達峰值，后續(xù)依細胞修復(fù)機制漸歸穩(wěn)態(tài)，NIH/3T3 修復(fù)最慢、EI 衰減半衰期約 8 min，遠超 HEK293（5 min），為基因轉(zhuǎn)染 “窗口期” 把控提供關(guān)鍵時效參數(shù)，助益優(yōu)化外源基因?qū)霑r機。
（三）方法優(yōu)勢彰顯
對比傳統(tǒng)電穿孔檢測，本方法無需熒光染料、放射性標記，規(guī)避標記物干擾與潛在細胞毒性，契合綠色安全實驗需求；每秒多次阻抗采集，實時追蹤電穿孔各階段，時空分辨率躍升，捕捉瞬態(tài) “電穿孔脈沖” 與細胞響應(yīng)；且對不同細胞、電穿孔條件普適性佳，適配多元生物醫(yī)學(xué)場景，如依阻抗反饋實時調(diào) TENG 參數(shù)，精準控電穿孔強度，在難轉(zhuǎn)染細胞基因編輯中顯著提升轉(zhuǎn)染效率（相較于傳統(tǒng)法提升 30% - 40%），為高效細胞工程作業(yè)筑牢根基。
四、結(jié)論
本研究所創(chuàng)基于電阻抗譜的摩擦納米電穿孔定量法，憑借創(chuàng)新技術(shù)融合與精細實驗探究，解鎖電穿孔微觀進程 “量化密碼”，從阻抗頻譜異動精準映射電穿孔動態(tài)軌跡，多維度量化剖析電穿孔程度、時效特征，為細胞跨膜運輸調(diào)控提供銳利工具。未來，隨技術(shù)迭代升級，有望嵌入智能化生物芯片，于單細胞精準治療、合成生物學(xué)復(fù)雜體系構(gòu)建發(fā)揮更大效能，持續(xù)深挖細胞電生理奧秘，賦能生物醫(yī)學(xué)底層創(chuàng)新，拓寬生命微觀操控邊界。
