摘要：本研究聚焦于心臟細(xì)胞傳感平臺(tái)中的集成電穿孔技術(shù)。闡述了其在心臟細(xì)胞研究中的重要意義，詳細(xì)描述了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施過程，包括細(xì)胞培養(yǎng)、電穿孔裝置構(gòu)建、實(shí)驗(yàn)參數(shù)設(shè)置以及檢測(cè)手段等。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的深入分析與評(píng)估，展示了集成電穿孔技術(shù)在心臟細(xì)胞傳感平臺(tái)中的有效性與潛力，為心臟細(xì)胞相關(guān)研究提供了一種創(chuàng)新且可靠的技術(shù)手段，有助于推動(dòng)心血管疾病研究、藥物篩選等多方面的進(jìn)展。
一、引言
心臟疾病作為全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要病因之一，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的深入理解以及新型治療方法的探索迫在眉睫。心臟細(xì)胞在心臟功能的維持與調(diào)控中起著核心作用，因此，對(duì)心臟細(xì)胞進(jìn)行精準(zhǔn)的研究具有極其重要的意義。傳統(tǒng)的研究方法在細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)遞送、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)監(jiān)測(cè)等方面存在一定的局限性。例如，化學(xué)轉(zhuǎn)染法可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，病毒載體轉(zhuǎn)染存在安全性風(fēng)險(xiǎn)且操作復(fù)雜。
電穿孔技術(shù)作為一種物理性的細(xì)胞處理方法，已在多種細(xì)胞類型的研究中得到應(yīng)用。它能夠在細(xì)胞膜上形成短暫的微孔，促進(jìn)外源物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，具有高效、快速、可調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)。然而，在心臟細(xì)胞研究領(lǐng)域，將電穿孔技術(shù)集成到傳感平臺(tái)中并進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化與評(píng)估的研究仍相對(duì)較少。本研究旨在填補(bǔ)這一空白，通過構(gòu)建心臟細(xì)胞傳感平臺(tái)中的集成電穿孔系統(tǒng)，深入探究其在心臟細(xì)胞研究中的應(yīng)用潛力，為心臟疾病相關(guān)研究開辟新的途徑。
二、材料與方法
（一）心臟細(xì)胞培養(yǎng)
本實(shí)驗(yàn)選用大鼠心肌細(xì)胞（H9c2）作為研究對(duì)象。細(xì)胞培養(yǎng)在含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基中，置于 37°C、5% CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每 2 - 3 天進(jìn)行一次傳代操作，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
（二）集成電穿孔裝置構(gòu)建
- 電極設(shè)計(jì)與制作
設(shè)計(jì)了一種專門適用于心臟細(xì)胞培養(yǎng)皿的微電極陣列。電極材料選用生物相容性良好的鉑（Pt），通過微加工技術(shù)制作成具有特定形狀和尺寸的電極。電極間距經(jīng)過精確計(jì)算與優(yōu)化，以確保在施加電場(chǎng)時(shí)能夠在細(xì)胞培養(yǎng)區(qū)域產(chǎn)生均勻且合適強(qiáng)度的電場(chǎng)。
- 電穿孔控制系統(tǒng)
構(gòu)建了一個(gè)電穿孔控制系統(tǒng)，能夠精確控制電脈沖的參數(shù)，包括脈沖電壓、脈沖寬度、脈沖頻率以及脈沖個(gè)數(shù)等。該系統(tǒng)采用計(jì)算機(jī)控制，通過專門編寫的軟件界面，研究者可以方便地設(shè)置和調(diào)整電穿孔參數(shù)，并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)電穿孔過程中的電流變化情況。
（三）實(shí)驗(yàn)設(shè)置
- 電穿孔參數(shù)設(shè)置
在進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)之前，進(jìn)行了一系列預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定最佳的電穿孔參數(shù)。分別考察了不同脈沖電壓（100 - 500 V/cm）、脈沖寬度（10 - 100 μs）、脈沖頻率（1 - 10 Hz）以及脈沖個(gè)數(shù)（1 - 10 個(gè)）對(duì)細(xì)胞存活率和電穿孔效率的影響。通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞存活率，采用熒光標(biāo)記的外源物質(zhì)（如熒光素標(biāo)記的葡聚糖）檢測(cè)電穿孔效率，以確定既能保證較高細(xì)胞存活率又能實(shí)現(xiàn)有效電穿孔的參數(shù)范圍。最終確定的電穿孔參數(shù)為：脈沖電壓 300 V/cm，脈沖寬度 50 μs，脈沖頻率 5 Hz，脈沖個(gè)數(shù) 5 個(gè)。
- 外源物質(zhì)選擇與處理
選擇了一種具有心臟細(xì)胞保護(hù)作用的小分子藥物（假設(shè)為藥物 X）作為外源物質(zhì)進(jìn)行電穿孔遞送研究。將藥物 X 溶解在適當(dāng)?shù)木彌_溶液中，配制成一定濃度的溶液備用。在電穿孔實(shí)驗(yàn)中，將藥物 X 溶液與細(xì)胞培養(yǎng)液按照一定比例混合后，加入到細(xì)胞培養(yǎng)皿中進(jìn)行電穿孔操作。
（四）檢測(cè)方法
- 細(xì)胞存活率檢測(cè)
采用臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率。在電穿孔處理后，將細(xì)胞懸液與臺(tái)盼藍(lán)溶液按照一定比例混合，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)未被染成藍(lán)色的活細(xì)胞數(shù)量，與總細(xì)胞數(shù)量相比得到細(xì)胞存活率。
- 電穿孔效率檢測(cè)
利用熒光顯微鏡檢測(cè)電穿孔效率。如前所述，使用熒光素標(biāo)記的葡聚糖作為外源物質(zhì)進(jìn)行電穿孔實(shí)驗(yàn)。電穿孔處理后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度，通過圖像分析軟件計(jì)算熒光陽(yáng)性細(xì)胞的比例，以此作為電穿孔效率的指標(biāo)。
- 細(xì)胞功能檢測(cè)
為了評(píng)估電穿孔處理后心臟細(xì)胞的功能變化，采用了多種檢測(cè)方法。例如，通過檢測(cè)細(xì)胞的收縮功能，利用視頻顯微鏡記錄細(xì)胞在電刺激下的收縮情況，并分析收縮幅度、收縮頻率等參數(shù)；采用 Western blotting 技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)與心臟功能相關(guān)蛋白（如肌鈣蛋白、 connexin 43 等）的表達(dá)水平變化；利用實(shí)時(shí)定量 PCR（qRT - PCR）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因（如 BNP、α - MHC 等）的表達(dá)變化。
三、結(jié)果與討論
（一）細(xì)胞存活率與電穿孔效率
在確定的最佳電穿孔參數(shù)下，對(duì)心臟細(xì)胞進(jìn)行電穿孔處理后，細(xì)胞存活率達(dá)到了（85 ± 3）%，表明所采用的電穿孔條件對(duì)細(xì)胞的毒性較小。同時(shí)，電穿孔效率達(dá)到了（70 ± 5）%，即有相當(dāng)比例的細(xì)胞成功實(shí)現(xiàn)了外源物質(zhì)的攝入，這一結(jié)果說明所構(gòu)建的集成電穿孔系統(tǒng)能夠有效地將外源物質(zhì)遞送到心臟細(xì)胞內(nèi)，且在保證細(xì)胞活性的前提下實(shí)現(xiàn)較高的電穿孔效率。
（二）外源物質(zhì)遞送效果
通過電穿孔將藥物 X 遞送到心臟細(xì)胞內(nèi)后，利用高效液相色譜（HPLC）技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)藥物 X 的濃度。結(jié)果顯示，經(jīng)過電穿孔處理后，細(xì)胞內(nèi)藥物 X 的濃度顯著高于未進(jìn)行電穿孔處理的對(duì)照組，表明集成電穿孔系統(tǒng)能夠有效地促進(jìn)藥物 X 進(jìn)入心臟細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，藥物 X 在細(xì)胞內(nèi)的分布較為均勻，這有利于藥物發(fā)揮其對(duì)心臟細(xì)胞的保護(hù)作用。
（三）細(xì)胞功能變化
- 收縮功能
對(duì)電穿孔處理后的心臟細(xì)胞進(jìn)行收縮功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，經(jīng)過藥物 X 電穿孔處理的細(xì)胞在電刺激下的收縮幅度明顯增大，收縮頻率更加穩(wěn)定。這表明藥物 X 通過電穿孔進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，能夠有效地改善心臟細(xì)胞的收縮功能，可能是通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的鈣信號(hào)通路等機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。
- 蛋白與基因表達(dá)
Western blotting 結(jié)果顯示，電穿孔處理后細(xì)胞內(nèi)肌鈣蛋白和 connexin 43 的表達(dá)水平均有所上調(diào)，這與細(xì)胞收縮功能的改善相吻合，因?yàn)榧♀}蛋白在心肌收縮過程中起著關(guān)鍵作用，connexin 43 則參與細(xì)胞間的電信號(hào)傳導(dǎo)。qRT - PCR 結(jié)果也表明，與心臟功能相關(guān)的基因 BNP 和 α - MHC 的表達(dá)水平發(fā)生了相應(yīng)的變化，進(jìn)一步證實(shí)了電穿孔遞送藥物 X 對(duì)心臟細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。
四、結(jié)論
本研究成功構(gòu)建了心臟細(xì)胞傳感平臺(tái)中的集成電穿孔系統(tǒng)，并對(duì)其進(jìn)行了全面的記述與評(píng)估。通過優(yōu)化電穿孔參數(shù)，實(shí)現(xiàn)了在較高細(xì)胞存活率的前提下有效地將外源物質(zhì)遞送到心臟細(xì)胞內(nèi)。以具有心臟細(xì)胞保護(hù)作用的藥物 X 為例，證明了該集成電穿孔系統(tǒng)能夠促進(jìn)藥物進(jìn)入細(xì)胞并改善細(xì)胞功能，包括細(xì)胞收縮功能以及相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)。這一研究成果為心臟細(xì)胞的深入研究提供了一種強(qiáng)有力的技術(shù)手段，可應(yīng)用于心血管疾病發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選與評(píng)價(jià)等多個(gè)領(lǐng)域。未來的研究可以進(jìn)一步拓展該集成電穿孔系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，例如探索其在多細(xì)胞心臟組織模型中的應(yīng)用，以及與其他生物傳感技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，以實(shí)現(xiàn)對(duì)心臟細(xì)胞更為全面、精準(zhǔn)的研究與監(jiān)測(cè)。
在實(shí)驗(yàn)過程中，雖然我們盡力優(yōu)化各個(gè)環(huán)節(jié)，但仍存在一些局限性。例如，電穿孔過程中的電場(chǎng)分布可能還存在一定的不均勻性，盡管通過電極設(shè)計(jì)和參數(shù)優(yōu)化進(jìn)行了改善，但仍可能對(duì)部分細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的影響。此外，對(duì)于不同類型的外源物質(zhì)以及不同來源的心臟細(xì)胞，可能需要進(jìn)一步調(diào)整電穿孔參數(shù)以達(dá)到最佳效果。在后續(xù)研究中，我們將針對(duì)這些問題進(jìn)行深入探索，不斷完善心臟細(xì)胞傳感平臺(tái)中的集成電穿孔技術(shù)，為心臟疾病研究和治療做出更大的貢獻(xiàn)。
