前言
HCP ELISA檢測(cè)方法必須要通過法規(guī)認(rèn)可的實(shí)驗(yàn)方法（ICH或FDA指南等）進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，以確保其能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確的結(jié)果。想要獲得準(zhǔn)確的HCP ELISA檢測(cè)結(jié)果，本質(zhì)上是要保證樣品中HCP的濃度高于試劑盒的定量下限（LOQ），同時(shí)HCP的檢測(cè)抗體還要處于過剩狀態(tài)，滿足這兩點(diǎn)就必須要對(duì)檢測(cè)樣品（過程樣品和最終的藥物原液）進(jìn)行稀釋線性驗(yàn)證。因此，稀釋線性（dilution linearity）是驗(yàn)證HCP ELISA方法特異性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)之一。在HCP檢測(cè)中，稀釋線性不佳的原因主要有兩種：一種是樣品中某些HCPs的抗體過剩條件不滿足，需要通過進(jìn)一步稀釋來達(dá)到“最小必要稀釋倍數(shù)”（MRD）；另一種是產(chǎn)品蛋白本身或產(chǎn)品配方緩沖液中的某些成分對(duì)HCP的檢測(cè)產(chǎn)生干擾，可以采用指定的樣品稀釋液（見文末）或者緩沖液置換等方式處理樣品來滿足檢測(cè)需求。關(guān)于樣品稀釋液，最優(yōu)的選擇是使用和標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液。Cygnus針對(duì)每種ELISA檢測(cè)方法都提供了相應(yīng)的樣品稀釋液，以確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。對(duì)于使用Cygnus HCP ELISA試劑盒的用戶，我們建議將可接受的稀釋線性定義為“在兩倍稀釋時(shí)，校正后的HCP濃度變化不超過±20%”。同時(shí)，還要避免檢測(cè)值靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測(cè)值不能低于定量下限的兩倍。接下來，本文將為您詳細(xì)解讀HCP ELISA方法學(xué)驗(yàn)證中有關(guān)線性稀釋的操作方法與注意事項(xiàng)。
 
為什么要建立稀釋線性？
在測(cè)試一個(gè)新的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA方法時(shí)，建立稀釋線性是第一項(xiàng)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，目的是確認(rèn)所選擇的HCP ELISA是否適用于您的過程樣品和藥物原液中的HCPs。當(dāng)稀釋線性確認(rèn)后，它將為進(jìn)一步的分析驗(yàn)證提供所需的實(shí)驗(yàn)條件信息，因此稀釋線性通常是最先進(jìn)行的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
 
具體來講，稀釋線性實(shí)驗(yàn)的目的是確定ELISA方法對(duì)樣品中HCPs的反應(yīng)曲線和全定量范圍。成功驗(yàn)證了稀釋線性意味著對(duì)存在于該樣品中的各種HCPs，抗體過剩條件已滿足，且樣品基質(zhì)不會(huì)影響HCP的定量，從而保證HCP ELISA檢測(cè)結(jié)果的可靠性。
 
如何進(jìn)行稀釋線性實(shí)驗(yàn)？
在進(jìn)行ELISA分析之前，任何可能超過定量上限（ULOQ）的樣品都應(yīng)該先進(jìn)行稀釋線性實(shí)驗(yàn)。其過程包括：用驗(yàn)證過的樣品稀釋液對(duì)HCP待檢樣品進(jìn)行多個(gè)梯度稀釋，然后對(duì)這些稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算每個(gè)稀釋樣品中校正后的HCP濃度（即測(cè)得的HCP濃度×稀釋倍數(shù)）。大多數(shù)情況下，在達(dá)到一定稀釋倍數(shù)后，稀釋樣品校正后的HCP濃度值會(huì)出現(xiàn)相對(duì)恒定狀態(tài)，那么該稀釋倍數(shù)則被稱為“最低需求稀釋度”（MRD）。
   
如下表案例，樣品在高濃度（未稀釋和1:2，1:4稀釋）時(shí)并未顯示出良好的稀釋線性，但隨著進(jìn)一步稀釋，我們可以確定一個(gè)MRD，即在此稀釋度實(shí)現(xiàn)了可接受的稀釋線性（見下表藍(lán)色行）。按照定義，當(dāng)校正后的HCP濃度在2倍稀釋之間的變化范圍不超過±20%時(shí)，即達(dá)到了可接受的稀釋線性，同時(shí)還要避免靠近定量下限，即稀釋樣品HCP檢測(cè)值不能低于定量下限的兩倍（在這個(gè)案例中1:64稀釋樣品HCP檢測(cè)值＜2倍LOQ，因此未計(jì)入統(tǒng)計(jì)）。變化百分比可以通過減去前一稀釋樣品濃度的校正值，然后將差值再除以前一個(gè)稀釋樣品濃度的校正值來計(jì)算。例如，1:2稀釋樣品相較未稀釋樣品的變化百分比為：[(233-146)/146]x100%=60%。
 

樣品稀釋梯度	HCP稀釋校正值 (ng/mL)	與前一個(gè)稀釋樣品 的變化百分比
未稀釋	146	NA
1:2	233	60%
1:4	312	34%
1:8	361	16%
1:16	356	1%
1:32	370	4%
1:64	未計(jì)算 (<2倍LOQ)	NA

從表中數(shù)據(jù)我們可以得出結(jié)論，該樣品的MRD為1:4，那么最終計(jì)算出HCP的濃度應(yīng)在MRD以下（或等于）和LOQ以上所有校正后HCP濃度的平均值（在此例中，應(yīng)取312、361、356和370的平均值即350ng/mL）。

在實(shí)際應(yīng)用中，我們應(yīng)當(dāng)對(duì)需要檢測(cè)HCP的所有樣品類型（包括過程樣品以及最終的藥物原液）進(jìn)行稀釋線性的評(píng)估，并將每種樣品類型和基質(zhì)的MRD值以及稀釋不同樣品的具體指導(dǎo)納入到SOP文件中。
 
稀釋線性不佳的原因與解決方法
對(duì)于HCP ELISA檢測(cè)，可能會(huì)出現(xiàn)某些HCPs稀釋線性不佳的情況，也就是樣品中存在某些HCPs的抗體過剩條件未被滿足。例如，個(gè)別高濃度的HCP可能對(duì)該特定HCP的抗體產(chǎn)生飽和，出現(xiàn)了“鉤子效應(yīng)（high-dose hook effect）”，從而導(dǎo)致該HCP的定量不準(zhǔn)確。
 
此外，某些伴隨蛋白（hitchhiker proteins）可能會(huì)與產(chǎn)物蛋白相互作用，并在純化過程中顯著富集，從而完全干擾整個(gè)分析的線性。
 
其他導(dǎo)致稀釋線性不佳的原因還有可能是產(chǎn)品配方（或過程樣品的緩沖溶液）中的某些成分干擾了檢測(cè)，對(duì)于Cygnus HCP ELISA試劑盒，已知的干擾因素包括極端pH、洗滌劑、有機(jī)溶劑、高蛋白濃度和高鹽濃度等，因此我們建議樣品的稀釋一定要使用和標(biāo)準(zhǔn)品相同的稀釋液，詳見下表。
 

貨號(hào)	品名	應(yīng)用	規(guī)格
I028	樣品稀釋液	適用于大部分HCP試劑盒，如CHO（F550-1）,E.coli（F1020, F410）等	100 ml, 500 ml, 1000 ml
I700	樣品稀釋液	適用于HEK 293 HCP（F650S）試劑盒	100 ml, 500 ml, 1000 ml
I094	樣品稀釋液	適用于MDCK（F800）和HeLa（F810）HCP試劑盒	100 ml, 500 ml, 1000 ml
I600	樣品稀釋液	適用于大部分Mix-N-Go系列Protein A檢測(cè)試劑盒（F600, F610, F740, F910, F950等）和核酸內(nèi)切酶殘留檢測(cè)試劑盒（F960）	25 ml, 100 ml
F031A	樣品稀釋液	適用于BSA（F030）檢測(cè)試劑盒	100 ml, 500 ml, 1000 ml
I800	樣品稀釋液	適用于PROchievA™ Protein A（F965）試劑盒	25 ml, 100 ml
F223A	樣品稀釋液	適用于NS/0 HCP（F220）試劑盒	100 ml, 500 ml, 1000 ml
F233A	樣品稀釋液	適用于A549 HCP（F230）試劑盒	100 ml, 500 ml
F213A	樣品稀釋液	適用于山羊IgG（F210）檢測(cè)試劑盒	100 ml, 500 ml, 1000 ml
F243A	樣品稀釋液	適用于山羊乳總蛋白（F230）檢測(cè)試劑盒	100 ml, 500 ml, 1000 ml

最后，我們?cè)俅螐?qiáng)調(diào)，只有在抗體過剩的情況下，劑量反應(yīng)曲線才會(huì)呈正斜率，檢測(cè)結(jié)果才是準(zhǔn)確的。

如果稀釋線性不佳的因素是由HCP抗體不足或樣品基質(zhì)干擾，那么隨著樣品的稀釋倍數(shù)增加，其測(cè)得的HCP濃度會(huì)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，因此需要通過進(jìn)一步稀釋樣品來達(dá)到MRD。如果是其他原因，也可以通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟來提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。如果增加樣品的稀釋倍數(shù)仍無法解決稀釋線性不佳的問題，則有可能是純化過程存在問題。
 
Cygnus針對(duì)每一種檢測(cè)試劑盒均提供相應(yīng)的QS（Qualification Summary）文件，如有需求歡迎點(diǎn)擊這里填寫信息索取，或者聯(lián)系Cygnus中國(guó)總代理西美杰。如果您在Cygnus HCP ELISA試劑盒的使用中遇到了稀釋線性相關(guān)問題且無法通過上述方法解決的，也歡迎您隨時(shí)聯(lián)系西美杰，我們的技術(shù)支持會(huì)針對(duì)您的問題提供相應(yīng)解決方法和建議。接下來我們還會(huì)陸續(xù)分享一系列關(guān)于HCP ELISA方法學(xué)驗(yàn)證的內(nèi)容，包括加標(biāo)回收以及HCP抗體適用性驗(yàn)證等，敬請(qǐng)關(guān)注。
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