馬爾尼菲青霉（Penicillium marneffei）作為一種獨特的雙相型真菌，在自然界中呈現(xiàn)出復(fù)雜的生活史，其在 25℃左右環(huán)境下呈菌絲相生長，而在 37℃人體體溫環(huán)境下則轉(zhuǎn)變?yōu)榻湍赶�，這種特殊的相變特性與它對人體的致病性緊密相關(guān)。作為東南亞地區(qū)及我國南方部分省份常見的深部致病真菌，馬爾尼菲青霉可引發(fā)嚴(yán)重的系統(tǒng)性感染，尤其在免疫功能低下人群，如艾滋病患者、器官移植受者等群體中，感染率及致死率頗高，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成顯著威脅。

深入探究馬爾尼菲青霉的致病機制、毒力因子以及開展抗真菌藥物靶點篩選等研究工作，迫切依賴高效、穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)化體系�；�因轉(zhuǎn)化技術(shù)能夠?qū)⑼庠椿�因精�?zhǔn)導(dǎo)入真菌細(xì)胞內(nèi)，通過跟蹤標(biāo)記基因表達、分析目的基因敲除或過表達后的表型變化，實現(xiàn)對真菌基因功能全方位解讀。目前，馬爾尼菲青霉的轉(zhuǎn)化方法雖有多種嘗試，諸如原生質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)化、農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化等，但均存在各自局限。原生質(zhì)體法操作繁瑣，原生質(zhì)體制備與再生環(huán)節(jié)易受環(huán)境因素干擾，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率波動大且重復(fù)性差；農(nóng)桿菌介導(dǎo)法則面臨著宿主范圍限制、轉(zhuǎn)化流程冗長等不足。

電穿孔技術(shù)，憑借其原理上借助短暫高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成可逆性微孔，促使外源 DNA 高效進入細(xì)胞內(nèi)部，具有操作簡便、轉(zhuǎn)化速度快、對細(xì)胞生理狀態(tài)影響相對小等優(yōu)勢，在眾多微生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域嶄露頭角。然而，在馬爾尼菲青霉轉(zhuǎn)化應(yīng)用中，尚未形成一套標(biāo)準(zhǔn)化、高效的電穿孔參數(shù)及流程，亟需系統(tǒng)性優(yōu)化，以解鎖其在該真菌研究中的巨大潛力，為馬爾尼菲青霉基礎(chǔ)研究與臨床防控研究搭建堅實技術(shù)橋梁。

實驗所采用的馬爾尼菲青霉菌株分離自臨床確診患者樣本，經(jīng)多輪純化與鑒定確保遺傳背景單一穩(wěn)定。選用攜帶潮霉素抗性基因（hph）作為篩選標(biāo)記的質(zhì)粒 pUC-HPH，該質(zhì)粒含有真菌通用啟動子，可驅(qū)動抗性基因在馬爾尼菲青霉中高效表達，以保證后續(xù)轉(zhuǎn)化子篩選準(zhǔn)確性與高效性。

在不同蔗糖、HEPES、MgCl₂濃度組合的 EB 緩沖液測試中，當(dāng)蔗糖濃度為 1.0M、HEPES 濃度為 30mM、MgCl₂濃度為 5mM，pH 值為 7.0 時，電穿孔后轉(zhuǎn)化子長出數(shù)量最多。相較于基礎(chǔ)配方（蔗糖 0.5M、HEPES 10mM、MgCl₂ 1mM），轉(zhuǎn)化效率提升約 2.5 倍。高濃度蔗糖有效維持細(xì)胞滲透壓，減少電脈沖下細(xì)胞破裂；適宜 HEPES 和 MgCl₂含量協(xié)同優(yōu)化細(xì)胞膜狀態(tài)，利于 DNA 分子接近與進入細(xì)胞，凸顯緩沖液成分精準(zhǔn)調(diào)配對電穿孔效果的關(guān)鍵支撐。

經(jīng)潮霉素抗性平板篩選、PCR 擴增及 Southern blot 分析，挑取的轉(zhuǎn)化子均穩(wěn)定攜帶 hph 基因，且多數(shù)呈現(xiàn)單拷貝整合入基因組，遺傳穩(wěn)定，在無潮霉素培養(yǎng)基連續(xù)傳代 5 次后仍保留抗性，有力證實優(yōu)化電穿孔體系可介導(dǎo)外源基因精準(zhǔn)、穩(wěn)定整合，滿足后續(xù)長期遺傳學(xué)研究需求。

本研究成功優(yōu)化電穿孔技術(shù)構(gòu)建馬爾尼菲青霉轉(zhuǎn)化體系，關(guān)鍵在于精細(xì)雕琢電穿孔各環(huán)節(jié)要素。緩沖液成分協(xié)同互作，從物理化學(xué)層面 “呵護” 細(xì)胞度過電脈沖沖擊；電壓、脈沖時間、次數(shù) “三位一體” 精密平衡，突破以往轉(zhuǎn)化 “瓶頸”。與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化方法相比，新體系摒棄原生質(zhì)體制備繁瑣流程與脆弱再生環(huán)節(jié)，規(guī)避農(nóng)桿菌介導(dǎo)的復(fù)雜互作限制，轉(zhuǎn)化周期從常規(guī)數(shù)周縮至 1 - 2 周，效率提升 3 - 4 倍，穩(wěn)定性大幅增強。

在醫(yī)學(xué)真菌研究版圖中，此體系為馬爾尼菲青霉致病性基因挖掘、抗藥機制剖析點亮明燈。借助該工具可敲除疑似毒力基因，對比野生株與突變株感染模型差異，鎖定致病關(guān)鍵因子；針對耐藥株，可轉(zhuǎn)化熒光標(biāo)記耐藥基因，追蹤表達調(diào)控，解析耐藥根源。未來，持續(xù)拓展該體系適配外源基因類型、優(yōu)化多基因共轉(zhuǎn)化流程，有望將馬爾尼菲青霉遺傳學(xué)研究推向縱深，為抗真菌新藥研發(fā)、臨床精準(zhǔn)防控注入創(chuàng)新活力，填補真菌致病機制與防治策略空白，守護易感人群健康福祉。

本研究通過系統(tǒng)性優(yōu)化電穿孔技術(shù)涉及的緩沖液配方、電穿孔參數(shù)以及感受態(tài)細(xì)胞制備與轉(zhuǎn)化后篩選流程，成功構(gòu)建高效、穩(wěn)定的馬爾尼菲青霉轉(zhuǎn)化體系。該體系顯著提升轉(zhuǎn)化效率、保障轉(zhuǎn)化子遺傳穩(wěn)定性，為馬爾尼菲青霉基礎(chǔ)遺傳學(xué)及相關(guān)醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究提供了可靠技術(shù)支撐，在拓展對馬爾尼菲青霉生物學(xué)認(rèn)知邊界、攻克臨床感染難題征程中邁出關(guān)鍵一步，隨著后續(xù)應(yīng)用拓展與完善，有望重塑馬爾尼菲青霉研究格局，助力真菌病防治革新。