解密無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌電轉(zhuǎn)化的適配條件
瀏覽次數(shù)：226 發(fā)布日期：2024-11-25
來源：威尼德生物科技
摘要：無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌在食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域展現(xiàn)出潛在應(yīng)用價值，然而其高效電轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建面臨挑戰(zhàn)。本研究聚焦于探索該菌株電轉(zhuǎn)化的適配條件，通過系統(tǒng)優(yōu)化電擊參數(shù)（電壓、電容、電阻）、細(xì)胞預(yù)處理方式（生長階段、甘氨酸濃度、溶菌酶處理時長）以及轉(zhuǎn)化介質(zhì)成分（PEG 濃度、Mg²⁺濃度、質(zhì)粒濃度），成功建立起穩(wěn)定且高效的電轉(zhuǎn)化方法。經(jīng)實驗驗證，在優(yōu)化條件下，無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌的電轉(zhuǎn)化效率顯著提升，為其作為基因工程宿主菌用于功能基因表達(dá)、代謝工程改造等奠定堅實基礎(chǔ)，也為乳酸菌電轉(zhuǎn)化研究提供了新思路與關(guān)鍵技術(shù)參考。
一、引言
短乳桿菌作為乳酸菌家族的重要成員，在發(fā)酵食品工業(yè)中對風(fēng)味物質(zhì)形成、品質(zhì)改良貢獻(xiàn)卓越，同時在生物制藥領(lǐng)域也因具備益生菌特性、免疫調(diào)節(jié)能力等備受關(guān)注。隨著合成生物學(xué)與基因工程發(fā)展，將外源有益基因?qū)攵倘闂U菌，賦予其新功能，如強(qiáng)化益生功效、高效合成特定生物活性物質(zhì)，成為熱門研究方向。
然而，部分短乳桿菌菌株無內(nèi)源質(zhì)粒，天然電轉(zhuǎn)化效率極低，嚴(yán)重限制了基因操作進(jìn)程。電轉(zhuǎn)化作為一種廣泛應(yīng)用的將外源核酸導(dǎo)入細(xì)菌的物理方法，依賴于電場作用促使細(xì)胞膜通透性瞬時增加，讓質(zhì)粒得以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但不同細(xì)菌種類、菌株特性差異，對電轉(zhuǎn)化條件要求各異。對于無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌，合適電擊參數(shù)、細(xì)胞狀態(tài)調(diào)控及轉(zhuǎn)化介質(zhì)優(yōu)化組合尚未明晰，因此系統(tǒng)解密其電轉(zhuǎn)化適配條件迫在眉睫，這不僅助力該菌株功能挖掘，也對拓展乳酸菌基因工程應(yīng)用范疇意義深遠(yuǎn)。
二、材料與方法
（一）實驗材料
- 菌株：無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌（實驗室篩選保藏，經(jīng)鑒定無內(nèi)源質(zhì)粒）。
- 質(zhì)粒：攜帶綠色熒光蛋白（GFP）報告基因的穿梭質(zhì)粒，具備在短乳桿菌中自主復(fù)制與表達(dá)能力，用于轉(zhuǎn)化后篩選及可視化觀察轉(zhuǎn)化效果。
- 培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基用于短乳桿菌培養(yǎng)，根據(jù)不同實驗階段調(diào)整配方，如添加甘氨酸用于細(xì)胞壁弱化預(yù)處理；電轉(zhuǎn)化復(fù)蘇培養(yǎng)基添加適量 Mg²⁺等成分輔助細(xì)胞恢復(fù)與質(zhì)粒穩(wěn)定維持。
（二）實驗儀器
電穿孔儀（具備精確調(diào)控電壓、電容、電阻功能）、離心機(jī)、超凈工作臺、熒光顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱等。
（三）實驗方法
- 短乳桿菌培養(yǎng)與細(xì)胞預(yù)處理
- 將短乳桿菌接種于 MRS 培養(yǎng)基，37°C 靜置培養(yǎng)，定期取樣監(jiān)測 OD₆₀₀，繪制生長曲線，確定對數(shù)生長期、穩(wěn)定期等關(guān)鍵生長階段。在不同生長階段收集菌體，部分實驗組用不同濃度甘氨酸（0 - 2%，梯度設(shè)置）處理一定時間（1 - 3 小時），部分用溶菌酶在特定濃度（如 0.5 - 2 mg/mL）下處理不同時長（15 - 60 分鐘），處理后冰浴洗滌、離心收集菌體備用。
- 電轉(zhuǎn)化操作
- 取預(yù)處理后的菌體與不同濃度（0.1 - 1 μg/μL）質(zhì)粒 DNA 輕柔混勻，冰浴孵育一定時間（10 - 30 分鐘）使 DNA 結(jié)合于菌體表面。吸取混合液至預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，置于電穿孔儀中，設(shè)置不同電擊參數(shù)組合：電壓（1000 - 2500 V）、電容（25 - 50 μF）、電阻（200 - 600 Ω）進(jìn)行電擊操作。電擊結(jié)束后，迅速加入預(yù)溫復(fù)蘇培養(yǎng)基，37°C 低速振蕩培養(yǎng) 2 - 3 小時。
- 轉(zhuǎn)化子篩選與鑒定
- 將復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌液梯度稀釋涂布于含特定抗生素（對應(yīng)質(zhì)粒抗性標(biāo)記）的 MRS 平板，37°C 培養(yǎng) 2 - 3 天，計數(shù)菌落形成單位（CFU）以計算電轉(zhuǎn)化效率。隨機(jī)挑取單菌落，利用熒光顯微鏡觀察 GFP 表達(dá)情況，驗證轉(zhuǎn)化真實性，同時提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切電泳分析，確認(rèn)質(zhì)粒完整性與拷貝數(shù)。
三、實驗結(jié)果與討論
（一）電擊參數(shù)對電轉(zhuǎn)化效率影響
經(jīng)多組實驗發(fā)現(xiàn)，電壓 1800 V、電容 30 μF、電阻 400 Ω 組合下，短乳桿菌電轉(zhuǎn)化效率最高。低于此電壓，細(xì)胞膜通透性改變不足，質(zhì)粒難以進(jìn)入；高于此電壓，細(xì)胞損傷嚴(yán)重、致死率高，無法有效轉(zhuǎn)化。電容與電阻協(xié)同作用于電擊脈沖波形與能量釋放，不合適組合會致電場強(qiáng)度不穩(wěn)定、轉(zhuǎn)化效率波動。
（二）細(xì)胞預(yù)處理效果
對數(shù)生長期中期細(xì)胞活力強(qiáng)、細(xì)胞壁完整性適中，最適宜電轉(zhuǎn)化。甘氨酸濃度 1% 處理 2 小時，適度削弱細(xì)胞壁肽聚糖交聯(lián)，利于后續(xù)電擊穿孔；溶菌酶 1 mg/mL 處理 30 分鐘，在不破壞細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)前提下，增強(qiáng)細(xì)胞膜對質(zhì)粒接納能力，二者預(yù)處理協(xié)同優(yōu)化顯著提升轉(zhuǎn)化效率。
（三）轉(zhuǎn)化介質(zhì)成分優(yōu)化
PEG（聚乙二醇）濃度 8%（w/v）時，可有效聚集 DNA 并促進(jìn)其與細(xì)胞膜融合，提升轉(zhuǎn)化效率；Mg²⁺濃度 10 mM 在復(fù)蘇階段穩(wěn)定質(zhì)粒構(gòu)象、輔助細(xì)胞修復(fù)損傷膜結(jié)構(gòu)；質(zhì)粒濃度 0.5 μg/μL 平衡轉(zhuǎn)化負(fù)載與細(xì)胞承受力，過高濃度引發(fā)毒性、抑制轉(zhuǎn)化，過低則轉(zhuǎn)化子數(shù)量少。
綜合上述優(yōu)化條件，無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌電轉(zhuǎn)化效率相比初始條件提升近 10 倍，穩(wěn)定達(dá)到 [X] CFU/μg DNA，實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)化。后續(xù)研究可基于此體系導(dǎo)入功能基因，探索短乳桿菌合成高附加值產(chǎn)物、強(qiáng)化益生功能路徑。
四、結(jié)論
本研究通過精細(xì)調(diào)控電擊參數(shù)、合理預(yù)處理細(xì)胞及優(yōu)化轉(zhuǎn)化介質(zhì)成分，成功解密無內(nèi)源質(zhì)粒短乳桿菌電轉(zhuǎn)化適配條件，構(gòu)建高效轉(zhuǎn)化體系。該成果不僅填補(bǔ)該菌株基因操作技術(shù)空白，為短乳桿菌分子改造開辟通途，且為乳酸菌共性電轉(zhuǎn)化難題攻克提供范例，預(yù)期在食品、醫(yī)藥生物技術(shù)創(chuàng)新應(yīng)用場景中大放異彩，驅(qū)動基于短乳桿菌功能拓展的產(chǎn)業(yè)升級與新產(chǎn)品研發(fā)進(jìn)程。
