一、引言
真菌作為真核生物中的一個(gè)龐大類群，在生態(tài)系統(tǒng)中扮演著極為重要的角色，包括分解有機(jī)物、參與物質(zhì)循環(huán)、與其他生物形成共生關(guān)系等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，對(duì)真菌的研究已深入到基因?qū)用妫缯婢姆诸愯b定、遺傳多樣性分析、功能基因挖掘以及與宿主相互作用機(jī)制的探究等。而這些分子研究的首要前提是獲得高質(zhì)量、高純度的真菌 DNA。
傳統(tǒng)的真菌 DNA 提取方法，如 CTAB 法、SDS 法等，雖然在一定程度上能夠滿足需求，但往往存在操作步驟繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)、對(duì)某些特殊真菌提取效果不佳以及難以有效去除雜質(zhì)（如多糖、多酚等）等問題。氯化芐作為一種新型的 DNA 提取試劑，近年來在真菌 DNA 提取領(lǐng)域逐漸受到關(guān)注。它具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，能夠在相對(duì)溫和的條件下破壞真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)的 DNA 得以釋放，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)具有較好的去除作用，從而為真菌分子研究提供高質(zhì)量的 DNA 樣本。
二、氯化芐提取真菌 DNA 的原理
氯化芐（benzyl chloride），化學(xué)式為 C₇H₇Cl，是一種具有較強(qiáng)反應(yīng)活性的有機(jī)化合物。在真菌 DNA 提取過程中，其主要作用原理基于以下幾個(gè)方面：
（一）細(xì)胞壁破壞
真菌細(xì)胞壁的主要成分包括幾丁質(zhì)、葡聚糖等，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜且堅(jiān)韌。氯化芐能夠與細(xì)胞壁中的某些化學(xué)鍵發(fā)生反應(yīng)，如與幾丁質(zhì)中的氨基基團(tuán)形成共價(jià)鍵，從而削弱細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性。同時(shí)，氯化芐的親脂性使其能夠滲透進(jìn)入細(xì)胞壁的脂質(zhì)區(qū)域，進(jìn)一步破壞細(xì)胞壁的屏障功能，使細(xì)胞內(nèi)容物易于釋放。
（二）細(xì)胞膜裂解
在細(xì)胞壁被破壞后，氯化芐可繼續(xù)作用于細(xì)胞膜。細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層構(gòu)成，氯化芐能夠插入到磷脂分子之間，打亂細(xì)胞膜的脂質(zhì)排列，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性增加，最終使細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子，包括 DNA，得以釋放到提取緩沖液中。
（三）蛋白質(zhì)和雜質(zhì)去除
釋放到提取緩沖液中的 DNA 往往與蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)混合在一起。氯化芐在堿性條件下（通常在提取緩沖液中加入適量的氫氧化鈉），能夠使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，形成不溶性的沉淀。此外，氯化芐還可以與多糖分子發(fā)生一定程度的相互作用，改變多糖的物理化學(xué)性質(zhì)，使其在后續(xù)的提取步驟中更易于與 DNA 分離，從而提高 DNA 的純度。
三、氯化芐提取真菌 DNA 的實(shí)驗(yàn)方法
（一）實(shí)驗(yàn)材料與試劑
- 真菌樣品：選取不同種類的新鮮真菌子實(shí)體或菌絲體，如常見的香菇（Lentinula edodes）、平菇（Pleurotus ostreatus）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）等，用于實(shí)驗(yàn)研究。
- 氯化芐：分析純?cè)噭?gòu)自某知名化學(xué)試劑公司。
- 其他試劑：Tris - HCl（pH 8.0）、EDTA（pH 8.0）、氯化鈉（NaCl）、氫氧化鈉（NaOH）、氯仿、異戊醇、無水乙醇、70% 乙醇等，均為分析純。
- 實(shí)驗(yàn)儀器：高速離心機(jī)、微量移液器、渦旋振蕩器、恒溫水浴鍋、紫外分光光度計(jì)、瓊脂糖凝膠電泳儀等。
（二）實(shí)驗(yàn)步驟
- 真菌樣品預(yù)處理
- 對(duì)于新鮮的真菌子實(shí)體，用無菌刀片將其切成小塊，取約 0.1 - 0.2 g 放入預(yù)冷的研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末狀。對(duì)于菌絲體，可直接用無菌鑷子取適量放入研缽中，同樣加入液氮研磨。
- 將研磨好的樣品轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 離心管中，加入 500 μL 預(yù)熱至 65°C 的提取緩沖液（100 mM Tris - HCl pH 8.0，20 mM EDTA pH 8.0，1.4 M NaCl，2% CTAB，2% 氯化芐），立即渦旋混勻，使樣品充分懸浮。
- 細(xì)胞裂解與 DNA 釋放
- 將離心管置于 65°C 恒溫水浴鍋中溫育 30 - 60 分鐘，期間每隔 10 - 15 分鐘渦旋混勻一次，以確保細(xì)胞充分裂解，DNA 完全釋放。
- 蛋白質(zhì)去除
- 取出離心管，冷卻至室溫后，加入等體積的氯仿 - 異戊醇（24:1），輕輕顛倒混勻 10 - 15 次，使溶液形成乳濁液。
- 將離心管置于高速離心機(jī)中，12000 rpm 離心 10 - 15 分鐘，此時(shí)溶液分為三層，上層為含 DNA 的水相，中間為蛋白質(zhì)沉淀層，下層為有機(jī)相。
- 小心吸取上層水相至新的 1.5 mL 離心管中，避免吸到中間的蛋白質(zhì)沉淀層。
- DNA 沉淀與洗滌
- 向吸取的水相中加入 2 倍體積的預(yù)冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，此時(shí)可見白色的 DNA 絮狀沉淀析出。
- 將離心管置于 - 20°C 冰箱中靜置 30 - 60 分鐘，以促進(jìn) DNA 沉淀完全。
- 然后將離心管取出，12000 rpm 離心 10 - 15 分鐘，小心棄去上清液。
- 加入 1 mL 預(yù)冷的 70% 乙醇，輕輕顛倒離心管，洗滌 DNA 沉淀，12000 rpm 離心 5 - 10 分鐘，再次棄去上清液。
- 將離心管倒置在干凈的濾紙上，讓殘留的乙醇自然揮發(fā)干，注意不要讓 DNA 沉淀完全干燥，否則會(huì)影響其溶解性。
- DNA 溶解與保存
- 向離心管中加入 50 - 100 μL 無菌水或 TE 緩沖液（10 mM Tris - HCl pH 8.0，1 mM EDTA pH 8.0），將 DNA 沉淀輕輕彈起，使其溶解。
- 將溶解后的 DNA 溶液置于 - 20°C 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/li>
四、氯化芐法與傳統(tǒng)提取方法的對(duì)比
（一）提取效率
為了評(píng)估氯化芐法與傳統(tǒng)的 CTAB 法和 SDS 法在真菌 DNA 提取效率方面的差異，我們選取了三種不同的真菌樣品（香菇、平菇和酵母菌），分別采用三種方法進(jìn)行 DNA 提取，并利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定提取得到的 DNA 濃度。結(jié)果表明，氯化芐法提取得到的 DNA 濃度在三種真菌中均顯著高于 CTAB 法和 SDS 法（圖 1）。例如，在香菇樣品中，氯化芐法提取的 DNA 濃度平均為 350 ng/μL，而 CTAB 法和 SDS 法分別為 180 ng/μL 和 200 ng/μL。這說明氯化芐法能夠更有效地從真菌細(xì)胞中釋放出 DNA，提高了 DNA 的提取產(chǎn)量。
（二）純度分析
通過測(cè)定 DNA 樣品在 260 nm 和 280 nm 處的吸光度比值（A₂₆₀/A₂₈₀）來評(píng)估 DNA 的純度。一般來說，純凈的 DNA 樣品 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值應(yīng)在 1.8 - 2.0 之間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯化芐法提取的 DNA 樣品 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值在三種真菌中均接近 1.8 - 2.0，表明其純度較高，蛋白質(zhì)等雜質(zhì)含量較低。相比之下，CTAB 法和 SDS 法提取的 DNA 樣品 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值部分偏離該范圍，說明存在一定程度的蛋白質(zhì)污染（表 1）。此外，對(duì)提取的 DNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，氯化芐法得到的 DNA 條帶清晰、完整，無明顯拖尾現(xiàn)象，進(jìn)一步證明了其較高的純度（圖 2）。
（三）操作時(shí)間
記錄三種方法從真菌樣品處理開始到獲得最終 DNA 溶液的整個(gè)操作過程所需時(shí)間。結(jié)果顯示，氯化芐法的操作時(shí)間明顯短于 CTAB 法和 SDS 法。氯化芐法整個(gè)提取過程大約需要 2 - 3 小時(shí)，而 CTAB 法和 SDS 法通常需要 4 - 6 小時(shí)。這主要是因?yàn)槁然S法在細(xì)胞裂解和雜質(zhì)去除步驟中效率更高，減少了繁瑣的操作步驟和溫育時(shí)間。
綜上所述，氯化芐法在真菌 DNA 提取效率、純度和操作時(shí)間方面均表現(xiàn)出優(yōu)于傳統(tǒng)提取方法的特性，為真菌分子研究提供了一種更為高效、便捷的 DNA 提取手段。
五、氯化芐法在真菌分子研究中的應(yīng)用
（一）真菌分類鑒定
真菌的分類鑒定傳統(tǒng)上主要依據(jù)形態(tài)學(xué)特征，但隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于 DNA 序列分析的分子鑒定方法已成為真菌分類學(xué)的重要手段。利用氯化芐法提取不同真菌的 DNA，然后擴(kuò)增其特定的基因片段，如 ITS（Internal Transcribed Spacer）區(qū)域、18S rRNA 基因等，通過對(duì)這些基因序列的測(cè)定和分析，可以準(zhǔn)確地確定真菌的種屬關(guān)系。例如，在對(duì)一些形態(tài)相似但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的真菌種類進(jìn)行鑒定時(shí)，氯化芐法提取的高質(zhì)量 DNA 能夠保證 PCR 擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性，從而避免了因 DNA 質(zhì)量問題導(dǎo)致的錯(cuò)誤鑒定。通過對(duì)大量真菌樣本的 ITS 序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以清晰地展示不同真菌類群之間的進(jìn)化關(guān)系，為真菌分類系統(tǒng)的完善提供了有力的分子證據(jù)。
（二）遺傳多樣性分析
研究真菌群體的遺傳多樣性對(duì)于了解其生態(tài)適應(yīng)性、進(jìn)化歷程以及種質(zhì)資源保護(hù)等具有重要意義。氯化芐法提取的真菌 DNA 可用于多種遺傳多樣性分析方法，如 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）和 SSR（Simple Sequence Repeats）等分子標(biāo)記技術(shù)。以 AFLP 分析為例，首先用限制性內(nèi)切酶對(duì)氯化芐法提取的 DNA 進(jìn)行酶切，然后連接特定的接頭，再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析，可以檢測(cè)到不同真菌個(gè)體之間的多態(tài)性條帶，這些條帶反映了真菌基因組 DNA 的差異。對(duì)多個(gè)真菌群體進(jìn)行 AFLP 分析，可以計(jì)算各種遺傳多樣性參數(shù)，如多態(tài)性位點(diǎn)比例、Nei's 基因多樣性指數(shù)等，從而揭示不同群體之間的遺傳分化程度和基因流情況。例如，在對(duì)某一地區(qū)的野生香菇群體進(jìn)行遺傳多樣性研究時(shí)，氯化芐法提取的 DNA 為 AFLP 分析提供了穩(wěn)定可靠的模板，研究結(jié)果表明該地區(qū)香菇群體具有較高的遺傳多樣性，且不同地理種群之間存在一定程度的遺傳分化，這為香菇的野生資源保護(hù)和人工育種提供了重要的遺傳信息。
（三）功能基因研究
真菌中含有眾多具有重要生物學(xué)功能的基因，如參與次生代謝產(chǎn)物合成、抗逆性相關(guān)基因等。氯化芐法提取的高質(zhì)量真菌 DNA 可用于這些功能基因的克隆、表達(dá)分析和功能驗(yàn)證。例如，在研究某種藥用真菌中具有抗腫瘤活性的次生代謝產(chǎn)物合成途徑時(shí)，首先利用氯化芐法提取該真菌的 DNA，然后通過構(gòu)建基因組文庫(kù)或采用 PCR 技術(shù)克隆相關(guān)的功能基因。將克隆得到的基因?qū)氲胶线m的表達(dá)載體中，在宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，通過對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的分析和活性測(cè)定，深入了解該基因在次生代謝產(chǎn)物合成過程中的作用機(jī)制。此外，還可以利用基因編輯技術(shù)，如 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，對(duì)氯化芐法提取的 DNA 進(jìn)行基因敲除或定點(diǎn)突變，進(jìn)一步研究功能基因?qū)φ婢L(zhǎng)發(fā)育、代謝調(diào)控以及與環(huán)境互作等方面的影響。
六、結(jié)論
氯化芐在真菌 DNA 提取中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其基于對(duì)真菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的有效破壞以及對(duì)雜質(zhì)的良好去除能力，能夠快速、高效地提取高質(zhì)量的真菌 DNA。通過與傳統(tǒng)提取方法的對(duì)比實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了氯化芐法在提取效率、純度和操作時(shí)間方面的優(yōu)越性。在真菌分子研究的多個(gè)領(lǐng)域，包括分類鑒定、遺傳多樣性分析和功能基因研究等，氯化芐法提取的 DNA 都能夠?yàn)橄嚓P(guān)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)材料，有力地推動(dòng)了真菌分子生物學(xué)的發(fā)展。然而，氯化芐作為一種化學(xué)試劑具有一定的毒性，在實(shí)驗(yàn)操作過程中需要注意安全防護(hù)。未來，隨著對(duì)氯化芐提取真菌 DNA 機(jī)制的進(jìn)一步深入研究，有望進(jìn)一步優(yōu)化該方法，使其在真菌分子研究領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。同時(shí)，也需要探索氯化芐與其他新型技術(shù)或試劑的聯(lián)合應(yīng)用，以應(yīng)對(duì)日益復(fù)雜和多樣化的真菌研究需求。
