核酸雜交在食品微生物檢驗中的應(yīng)用探微
一、引言
二、核酸雜交原理
三、核酸雜交技術(shù)分類
（一）固相雜交
（一）食源性致病菌檢測
（一）優(yōu)勢
（一）固相雜交
- 斑點雜交（Dot Blot Hybridization）
- 實驗步驟：首先將提取的食品樣品中的核酸固定在固相支持物（如硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，通常采用點樣的方式，使核酸形成一個個斑點。然后將標記有放射性同位素（如 ³²P）或非放射性標記物（如地高辛、生物素等）的核酸探針與膜上的核酸進行雜交。雜交后，通過檢測標記物的信號來判斷是否存在雜交反應(yīng)。例如，若使用放射性同位素標記的探針，可通過放射自顯影技術(shù)檢測雜交斑點；若為非放射性標記，則可利用相應(yīng)的免疫檢測或化學(xué)顯色反應(yīng)進行檢測。
- 應(yīng)用實例：在檢測食品中的大腸桿菌 O157:H7 時，可以提取食品樣品中的總核酸，點樣于硝酸纖維素膜上，用特異性針對大腸桿菌 O157:H7 的核酸探針進行斑點雜交。若樣品中含有該菌，探針與靶核酸雜交后，通過檢測標記物信號即可確定其存在。
- Southern 雜交（Southern Blot Hybridization）
- 實驗步驟：先對食品樣品中的 DNA 進行限制性內(nèi)切酶消化，將消化后的 DNA 片段通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，然后將凝膠中的 DNA 片段轉(zhuǎn)移到固相支持物（如尼龍膜）上。接著，與標記的核酸探針進行雜交。雜交后，通過檢測標記物的信號確定與探針互補的 DNA 片段的大小和位置。
- 應(yīng)用實例：在檢測食品中特定基因工程微生物時，可利用 Southern 雜交確定轉(zhuǎn)入微生物基因組中的外源基因的存在、數(shù)量和整合位置。例如，對于轉(zhuǎn)基因大豆制品中轉(zhuǎn)入的特定抗蟲基因，可提取大豆基因組 DNA，經(jīng)酶切、電泳、轉(zhuǎn)移后，用抗蟲基因的特異性探針進行雜交檢測。
- Northern 雜交（Northern Blot Hybridization）
- 實驗步驟：與 Southern 雜交類似，但檢測的對象是 RNA。首先提取食品樣品中的總 RNA，經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，再與標記的核酸探針雜交，通過檢測標記物信號確定特定 RNA 分子的表達水平和大小。
- 應(yīng)用實例：在研究食品發(fā)酵過程中微生物基因表達調(diào)控時，可采用 Northern 雜交檢測發(fā)酵微生物在不同發(fā)酵階段特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的量的變化，從而了解發(fā)酵過程中微生物代謝途徑相關(guān)基因的表達規(guī)律。
（一）食源性致病菌檢測
- 沙門氏菌檢測
- 實驗步驟：首先采集食品樣品（如肉類、蛋類等），采用適當?shù)姆椒ㄌ崛∑渲械奈⑸锖怂�。設(shè)計針對沙門氏菌特異性基因（如 invA 基因）的核酸探針，可采用化學(xué)合成法制備探針，并標記上合適的標記物（如地高辛）。將提取的核酸與標記探針在適宜的雜交緩沖液中進行雜交反應(yīng)，雜交條件可設(shè)置為 50°C 左右，雜交時間 1 - 2 小時。雜交后，通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測雜交信號，即先將雜交體與包被在微孔板上的抗地高辛抗體結(jié)合，再加入酶標二抗和底物進行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色深淺判斷是否存在沙門氏菌核酸雜交體，從而確定樣品中是否有沙門氏菌污染。
- 應(yīng)用效果：與傳統(tǒng)的培養(yǎng)法相比，核酸雜交法檢測沙門氏菌的時間可縮短至 1 - 2 天，而傳統(tǒng)培養(yǎng)法通常需要 3 - 5 天甚至更長時間。并且核酸雜交法的靈敏度更高，能夠檢測到更低濃度的沙門氏菌，可檢測限可達到 10³CFU/g 以下，有效提高了對低污染水平沙門氏菌的檢測能力。
- 金黃色葡萄球菌檢測
- 實驗步驟：對于食品樣品（如乳制品、糕點等）中的金黃色葡萄球菌檢測，先進行增菌培養(yǎng)以富集目標菌，然后提取核酸。設(shè)計針對金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因（nuc 基因）的探針，用生物素標記。將提取的核酸與標記探針在雜交管中進行雜交，雜交溫度約 45°C，時間約 90 分鐘。雜交后，利用親和素 - 酶結(jié)合物與生物素標記的雜交體結(jié)合，加入底物后通過比色法檢測雜交信號。
- 應(yīng)用效果：核酸雜交檢測金黃色葡萄球菌能夠避免傳統(tǒng)生化鑒定方法中因菌株表型變異導(dǎo)致的誤判。其特異性可達 95% 以上，靈敏度可檢測到 10² - 10³CFU/g 的金黃色葡萄球菌，有助于更準確地監(jiān)測食品中金黃色葡萄球菌的污染情況，尤其是在低濃度污染時能及時發(fā)現(xiàn)問題，保障食品安全。
- 假單胞菌檢測
- 實驗步驟：在檢測食品（如新鮮蔬菜、肉類等冷藏食品）中的假單胞菌時，從食品樣品中提取總核酸。針對假單胞菌的特定基因序列（如 16S rRNA 基因片段）設(shè)計核酸探針，采用放射性同位素 ³²P 標記。將提取的核酸與標記探針在雜交袋中進行雜交，雜交溫度控制在 48°C 左右，雜交時間 1.5 小時。雜交后，通過放射自顯影技術(shù)檢測雜交信號，若出現(xiàn)雜交條帶則表明樣品中有假單胞菌存在。
- 應(yīng)用效果：傳統(tǒng)的平板計數(shù)法檢測假單胞菌需要較長時間的培養(yǎng)（2 - 3 天），且難以區(qū)分活細胞和死細胞。而核酸雜交法可直接檢測核酸，不受細胞死活狀態(tài)影響，能在 1 - 2 天內(nèi)快速檢測出假單胞菌，并且可以對假單胞菌的種類進行初步鑒定，有助于及時采取措施防止食品腐敗變質(zhì)。
- 酵母和霉菌檢測
- 實驗步驟：對于食品（如水果制品、面包等）中的酵母和霉菌檢測，先提取樣品中的核酸。設(shè)計針對酵母和霉菌保守基因序列（如 ITS 區(qū)域）的核酸探針，可采用熒光素標記。將提取的核酸與標記探針在微量離心管中進行液相雜交，雜交溫度 52°C，時間 1 小時。雜交后，利用熒光檢測儀檢測雜交體的熒光信號，根據(jù)熒光強度判斷酵母和霉菌的存在和相對含量。
- 應(yīng)用效果：核酸雜交法檢測酵母和霉菌比傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法更靈敏，能夠檢測到更低數(shù)量的酵母和霉菌細胞，可檢測限可達到 10²CFU/g 左右。而且可以在不進行培養(yǎng)的情況下直接檢測，大大縮短了檢測時間，對于控制食品發(fā)酵過程中的微生物群落以及防止食品腐敗具有重要意義。
- 雙歧桿菌檢測
- 實驗步驟：在檢測酸奶等發(fā)酵乳制品中的雙歧桿菌時，提取樣品中的微生物核酸。設(shè)計針對雙歧桿菌特異性 16S rRNA 基因序列的核酸探針，用地高辛標記。將提取的核酸與標記探針在雜交微孔板中進行雜交，雜交條件為 55°C，雜交時間 1.2 小時。雜交后，通過酶聯(lián)免疫反應(yīng)檢測雜交信號，先加入抗地高辛抗體，再加入酶標二抗和底物顯色，根據(jù)顏色變化判斷雙歧桿菌的存在和數(shù)量。
- 應(yīng)用效果：傳統(tǒng)的平板計數(shù)法檢測雙歧桿菌需要進行選擇性培養(yǎng)，操作繁瑣且容易受到其他微生物的干擾。核酸雜交法能夠特異性地檢測雙歧桿菌，不受其他乳酸菌等微生物的影響，檢測結(jié)果更準確。其靈敏度可滿足對發(fā)酵乳制品中雙歧桿菌含量檢測的要求，有助于評估發(fā)酵乳制品的品質(zhì)和保健功能。
- 嗜酸乳桿菌檢測
- 實驗步驟：從食品樣品（如發(fā)酵蔬菜、酸奶等）中提取核酸，針對嗜酸乳桿菌的特定基因（如 S 層蛋白基因）設(shè)計核酸探針，采用生物素標記。將提取的核酸與標記探針在雜交管中進行雜交，雜交溫度 46°C，雜交時間 1.3 小時。雜交后，利用親和素 - 酶結(jié)合物與生物素標記的雜交體結(jié)合，加入底物后通過比色法檢測雜交信號，確定嗜酸乳桿菌的存在和數(shù)量。
- 應(yīng)用效果：核酸雜交檢測嗜酸乳桿菌能夠快速、準確地確定其在食品中的含量，為益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了可靠的檢測手段。與傳統(tǒng)檢測方法相比，可減少檢測時間約 1 - 2 天，且對嗜酸乳桿菌的特異性識別能力更強，能夠有效區(qū)分不同的乳酸菌菌株，保障益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量和功效。
（一）優(yōu)勢
- 高特異性：核酸雜交基于核酸分子的堿基互補配對原理，能夠特異性地識別目標微生物的核酸序列，有效避免了傳統(tǒng)檢測方法中因微生物表型相似而導(dǎo)致的誤判。例如，在檢測沙門氏菌時，核酸雜交探針可以準確地與沙門氏菌的特定基因序列雜交，而不會與其他非沙門氏菌微生物發(fā)生反應(yīng)。
- 高靈敏度：該技術(shù)能夠檢測到低濃度的微生物核酸，可檢測限通�？蛇_到 10² - 10³CFU/g 甚至更低，對于早期發(fā)現(xiàn)食品中的微生物污染具有重要意義。如在檢測金黃色葡萄球菌時，即使食品中存在少量的該菌，核酸雜交法也能檢測出來，而傳統(tǒng)培養(yǎng)法可能需要更長時間或更高濃度的菌才能檢測到。
- 快速檢測：相比傳統(tǒng)的培養(yǎng)法和生化鑒定法，核酸雜交法可大大縮短檢測時間，一般可在 1 - 2 天內(nèi)完成檢測，有些情況下甚至幾個小時即可得到結(jié)果。這對于需要快速判斷食品微生物安全性的情況（如食品生產(chǎn)線上的質(zhì)量控制、食物中毒事件的快速診斷等）非常有利。
- 對樣品要求較高：核酸雜交需要高質(zhì)量的核酸樣本，如果食品樣品中存在雜質(zhì)（如蛋白質(zhì)、多糖等）較多，可能會影響核酸提取的純度和質(zhì)量，進而影響雜交效果。例如，在檢測富含蛋白質(zhì)的肉類樣品中的微生物時，需要采用有效的蛋白質(zhì)去除方法，否則可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。
- 檢測成本較高：核酸雜交技術(shù)涉及到核酸探針的合成、標記以及一些特殊的檢測設(shè)備（如熒光檢測儀、放射自顯影設(shè)備等），使得檢測成本相對較高。這在一定程度上限制了該技術(shù)在一些小型食品企業(yè)或基層檢測機構(gòu)的廣泛應(yīng)用。
- 難以區(qū)分活細胞和死細胞：由于核酸雜交檢測的是微生物的核酸，無論是活細胞還是死細胞的核酸都可能與探針雜交，因此無法直接區(qū)分目標微生物的存活狀態(tài)。在某些情況下，如評估食品的衛(wèi)生安全性時，了解微生物的存活狀態(tài)是非常重要的，這就需要結(jié)合其他檢測方法（如熒光原位雜交結(jié)合活細胞染色技術(shù)）來解決。
- 新型探針的開發(fā)：研究人員將致力于開發(fā)更具特異性、靈敏度更高且成本更低的新型核酸探針。例如，利用納米材料標記的核酸探針，不僅可以提高檢測信號的強度，還可能降低探針的合成成本。同時，多靶點核酸探針的設(shè)計也將受到更多關(guān)注，通過一個探針同時檢測多個目標微生物或多個基因序列，提高檢測效率。
- 與其他技術(shù)的聯(lián)用：核酸雜交技術(shù)與其他檢測技術(shù)（如 PCR 技術(shù)、微流控技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等）的聯(lián)用將成為未來發(fā)展的重要趨勢。例如，PCR - 核酸雜交技術(shù)，先利用 PCR 技術(shù)對目標微生物核酸進行擴增，提高核酸濃度，然后再進行核酸雜交檢測，可進一步提高檢測的靈敏度和特異性；微流控芯片與核酸雜交技術(shù)結(jié)合，可以實現(xiàn)對多個樣品的同時快速檢測，提高檢測通量，滿足大規(guī)模食品微生物檢測的需求。
- 自動化檢測設(shè)備的研發(fā)：開發(fā)自動化程度高、操作簡便的核酸雜交檢測設(shè)備，減少人工操作誤差，提高檢測結(jié)果的準確性和重復(fù)性。這些設(shè)備將能夠集成核酸提取、雜交反應(yīng)、信號檢測和數(shù)據(jù)分析等多個步驟，使整個檢測過程更加高效、便捷，有望在食品生產(chǎn)企業(yè)的質(zhì)量控制和食品安全監(jiān)管部門的日常監(jiān)測中得到更廣泛的應(yīng)用。
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