產(chǎn)蛋下降綜合征（Egg Drop Syndrome，EDS）是由產(chǎn)蛋下降綜合征病毒引起的一種以產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋量顯著下降、蛋殼質(zhì)量變差等為主要特征的傳染病。該病毒屬于腺病毒科禽腺病毒屬，可在雞群中廣泛傳播，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
傳統(tǒng)的 EDSV 檢測(cè)方法包括病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)（如血凝抑制試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等）。病毒分離鑒定雖然準(zhǔn)確性高，但操作繁瑣、耗時(shí)較長(zhǎng)，需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和技術(shù)人員，且對(duì)樣品的要求較高；血清學(xué)檢測(cè)方法雖然相對(duì)簡(jiǎn)便快速，但存在一定的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果，且難以區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸檢測(cè)方法因其特異性強(qiáng)、敏感性高、快速等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為病毒檢測(cè)的重要手段。本研究利用生物素化探針技術(shù)建立一種針對(duì) EDSV 核酸的檢測(cè)方法，以期為 EDSV 的臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供一種更為有效的工具。
根據(jù) GenBank 中已公布的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒的保守基因序列，利用生物信息學(xué)軟件設(shè)計(jì)特異性生物素化探針。探針長(zhǎng)度為 [X] bp，其 5' 端標(biāo)記生物素。探針序列經(jīng) BLAST 比對(duì)驗(yàn)證其特異性后，由專業(yè)生物合成公司合成。
采用商品化的核酸提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)分別提取病毒標(biāo)準(zhǔn)株和臨床樣本中的核酸，提取的核酸用核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>
（五）生物素化探針雜交檢測(cè)
- 點(diǎn)膜
將提取的核酸樣本和陽(yáng)性、陰性對(duì)照核酸分別點(diǎn)樣于尼龍膜上，每個(gè)樣本點(diǎn)樣量為 [X]μL，然后將尼龍膜置于 80℃烘箱中烘烤 [X] min 以固定核酸。
- 預(yù)雜交
將點(diǎn)樣后的尼龍膜放入裝有預(yù)雜交液的雜交袋中，于雜交爐中 42℃預(yù)雜交 [X] h，以封閉尼龍膜上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。
- 雜交
將生物素化探針加入雜交液中，使其終濃度為 [X] ng/mL，然后將雜交液倒入雜交袋中，42℃雜交 [X] h。
- 洗膜
雜交結(jié)束后，取出尼龍膜，依次用不同濃度的鹽溶液和洗滌液在不同溫度下進(jìn)行洗膜，以去除未結(jié)合的探針，洗膜條件為：先用 2×SSC/0.1% SDS 溶液在室溫下洗膜 [X] min，然后用 0.1×SSC/0.1% SDS 溶液在 65℃下洗膜 [X] min。
- 免疫檢測(cè)
將洗膜后的尼龍膜放入含有地高辛標(biāo)記的抗生物素抗體的溶液中，室溫孵育 [X] h，然后用洗滌液洗膜 [X] 次，每次 [X] min。
- 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
將洗膜后的尼龍膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育 [X] min，然后在暗室中用 X 光膠片曝光，顯影、定影后觀察結(jié)果。
（六）特異性試驗(yàn)
以產(chǎn)蛋下降綜合征病毒標(biāo)準(zhǔn)株核酸為陽(yáng)性對(duì)照，以雞常見(jiàn)的其他病毒（如新城疫病毒、禽流感病毒、傳染性支氣管炎病毒等）核酸為陰性對(duì)照，按照上述生物素化探針雜交檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)估探針的特異性。
（七）敏感性試驗(yàn)
將產(chǎn)蛋下降綜合征病毒標(biāo)準(zhǔn)株核酸進(jìn)行 10 倍系列稀釋，從 [初始濃度] 開(kāi)始，共稀釋 [X] 個(gè)梯度，分別提取各稀釋度核酸，然后用生物素化探針雜交檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，確定該方法能夠檢測(cè)到的最低病毒核酸濃度，以評(píng)估其敏感性。
（八）臨床樣本檢測(cè)
采用建立的生物素化探針雜交檢測(cè)方法對(duì)采集的臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，并與傳統(tǒng)的病毒分離鑒定和血清學(xué)檢測(cè)方法（如血凝抑制試驗(yàn)）結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算該方法的符合率。
三、結(jié)果
（一）生物素化探針雜交檢測(cè)結(jié)果
在化學(xué)發(fā)光 X 光膠片上，陽(yáng)性對(duì)照樣本出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)條帶，而陰性對(duì)照樣本無(wú)雜交信號(hào)條帶。臨床樣本中，[X] 份樣本出現(xiàn)陽(yáng)性雜交信號(hào)，表明檢測(cè)到產(chǎn)蛋下降綜合征病毒核酸。
（二）特異性試驗(yàn)結(jié)果
生物素化探針雜交檢測(cè)方法僅對(duì)產(chǎn)蛋下降綜合征病毒核酸呈陽(yáng)性反應(yīng)，而對(duì)雞常見(jiàn)的其他病毒核酸均呈陰性反應(yīng)，表明該探針具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確區(qū)分 EDSV 與其他病毒。
（三）敏感性試驗(yàn)結(jié)果
經(jīng)過(guò) 10 倍系列稀釋的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒核酸檢測(cè)結(jié)果顯示，該生物素化探針雜交檢測(cè)方法能夠檢測(cè)到的最低病毒核酸濃度為 [X] copies/mL，表明該方法具有較高的敏感性。
（四）臨床樣本檢測(cè)結(jié)果
對(duì)采集的 [X] 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，生物素化探針雜交檢測(cè)方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣本 [X] 份，病毒分離鑒定方法檢測(cè)出陽(yáng)性樣本 [X] 份，血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)出陽(yáng)性樣本 [X] 份。與病毒分離鑒定方法相比，符合率為 [X]%；與血凝抑制試驗(yàn)相比，符合率為 [X]%。結(jié)果表明，生物素化探針雜交檢測(cè)方法與傳統(tǒng)檢測(cè)方法具有較好的一致性，且能更準(zhǔn)確地檢測(cè)出臨床樣本中的 EDSV 核酸。
四、討論
本研究成功建立了一種基于生物素化探針的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒核酸檢測(cè)方法。通過(guò)精心設(shè)計(jì)特異性生物素化探針，并優(yōu)化雜交檢測(cè)條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì) EDSV 核酸的高效、特異檢測(cè)。
在生物素化探針的設(shè)計(jì)方面，依據(jù) EDSV 的保守基因序列設(shè)計(jì)探針，確保了探針的特異性。同時(shí)，在探針的 5' 端標(biāo)記生物素，為后續(xù)的雜交檢測(cè)提供了便利。在雜交檢測(cè)過(guò)程中，對(duì)預(yù)雜交、雜交、洗膜等各個(gè)環(huán)節(jié)的條件進(jìn)行了優(yōu)化，如預(yù)雜交時(shí)間和溫度、雜交液中探針濃度、洗膜的鹽濃度和溫度等，這些優(yōu)化措施有助于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和敏感性。
特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該生物素化探針能夠準(zhǔn)確識(shí)別 EDSV 核酸，而不受其他雞常見(jiàn)病毒核酸的干擾，這為臨床診斷中準(zhǔn)確區(qū)分 EDSV 感染提供了有力保障。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法能夠檢測(cè)到較低濃度的病毒核酸，優(yōu)于部分傳統(tǒng)檢測(cè)方法，能夠在病毒感染早期或低病毒載量時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，有利于及時(shí)發(fā)現(xiàn)疫情并采取防控措施。
臨床樣本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了該生物素化探針雜交檢測(cè)方法的可靠性。與病毒分離鑒定和血清學(xué)檢測(cè)方法相比，具有較高的符合率，且在檢測(cè)速度上具有明顯優(yōu)勢(shì)。病毒分離鑒定雖然是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)費(fèi)力，難以滿足臨床快速診斷的需求；血清學(xué)檢測(cè)方法易受疫苗免疫等因素影響，而核酸檢測(cè)方法直接針對(duì)病毒核酸，不受抗體產(chǎn)生的干擾，能更準(zhǔn)確地反映病毒的感染情況。
本研究建立的生物素化探針檢測(cè)方法在實(shí)際應(yīng)用中具有廣闊的前景。可用于養(yǎng)殖場(chǎng)的日常監(jiān)測(cè)，及時(shí)發(fā)現(xiàn) EDSV 感染雞群，采取隔離、消毒等防控措施，減少病毒的傳播和經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)，也可應(yīng)用于種雞場(chǎng)的檢疫，防止 EDSV 垂直傳播，保障種雞質(zhì)量和雛雞健康。此外，該方法還可為 EDSV 的流行病學(xué)研究提供重要的技術(shù)支持，有助于深入了解病毒的流行規(guī)律和變異情況。
然而，本方法也存在一些不足之處。例如，核酸提取過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，需要一定的儀器設(shè)備和專業(yè)技術(shù)人員操作；生物素化探針的合成成本較高，可能會(huì)限制其在一些基層養(yǎng)殖場(chǎng)的廣泛應(yīng)用。在今后的研究中，可進(jìn)一步探索簡(jiǎn)化核酸提取方法，降低探針合成成本，以提高該檢測(cè)方法的實(shí)用性和普及性。
綜上所述，本研究建立的基于生物素化探針的產(chǎn)蛋下降綜合征病毒核酸檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，為產(chǎn)蛋下降綜合征的診斷和防控提供了一種有效的技術(shù)手段，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
