高時(shí)空分辨可視化技術(shù)是腦科學(xué)研究的重要工具。熒光顯微成像技術(shù)在特異性、多樣性、圖像對(duì)比度和時(shí)空分辨率等方面具有顯著優(yōu)勢，但由于光在組織中的穿透深度有限，無創(chuàng)的熒光成像難以在活體水平獲取深層腦區(qū)神經(jīng)血管單元的高分辨結(jié)構(gòu)和功能信息。

因此，在腦科學(xué)研究中，熒光內(nèi)窺顯微成像技術(shù)受到越來越多研究者的青睞。得益于相關(guān)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)窺鏡探頭在保持高性能的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了小型化并提供了更大的靈活性，可以植入活體大腦的不同深度處，開展特定深層腦區(qū)的功能調(diào)控研究。

深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院林方睿團(tuán)隊(duì)發(fā)表綜述文章，介紹了基于梯度折射率透鏡和單根多模光纖這兩種探頭的植入式熒光內(nèi)窺顯微成像技術(shù)及其發(fā)展和迭代進(jìn)程，概述了它們?cè)诟叻直婊铙w腦成像研究中的應(yīng)用，以及在臨床神經(jīng)外科手術(shù)中的初步探索性應(yīng)用。最后，展望了熒光內(nèi)窺腦成像技術(shù)未來的發(fā)展前景。

研究背景
一、腦科學(xué)研究的重要性及相關(guān)計(jì)劃
腦科學(xué)研究在前沿學(xué)科中占據(jù)關(guān)鍵地位，Science雜志與上海交通大學(xué)聯(lián)合公布的125個(gè)最前沿科學(xué)問題中有16個(gè)與腦科學(xué)領(lǐng)域相關(guān)。歐盟、美國、日本和澳大利亞等陸續(xù)開啟腦科學(xué)研究計(jì)劃，“中國腦計(jì)劃”于2016年全面布局，明確了“一體兩翼”發(fā)展戰(zhàn)略，北京和上海也相繼成立腦科學(xué)與類腦研究中心，2021年“中國腦計(jì)劃”正式啟動(dòng)。腦科學(xué)研究不僅有助于探索未知大腦機(jī)制，還能為腦疾病尋找精準(zhǔn)診斷方案和治療策略。

二、大腦的工作原理及神經(jīng)血管單元（NVU）的重要性
大腦通過神經(jīng)元細(xì)胞間的生物電信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮調(diào)控功能，腦血管為神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)提供氧氣和營養(yǎng)并清除代謝產(chǎn)物。NVU由神經(jīng)元、血管、膠質(zhì)細(xì)胞、血腦屏障和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，會(huì)產(chǎn)生與大腦健康和疾病相關(guān)的各種功能反應(yīng)，如調(diào)節(jié)血腦屏障通透性、血管生成、血流動(dòng)力學(xué)反應(yīng)、神經(jīng)炎癥和干細(xì)胞活性等。在活體水平獲取NVU結(jié)構(gòu)和功能信息對(duì)腦科學(xué)研究至關(guān)重要，需要高時(shí)空分辨可視化技術(shù)。

三、現(xiàn)有腦影像技術(shù)的不足與熒光顯微成像技術(shù)的優(yōu)勢及局限
臨床腦影像技術(shù)如計(jì)算機(jī)斷層掃描成像、磁共振成像、正電子發(fā)射斷層成像等，空間分辨率為微米至亞毫米量級(jí)且耗時(shí)較長，難以滿足活體NVU成像需求。熒光顯微成像技術(shù)在研究目標(biāo)的特異性和多樣性、圖像對(duì)比度和時(shí)空分辨率等方面有顯著優(yōu)勢，但由于光在組織中的穿透深度有限，無創(chuàng)熒光成像難以獲取深層腦區(qū)NVU的高分辨結(jié)構(gòu)和功能信息。近紅外成像更適合活體應(yīng)用，但傳統(tǒng)熒光成像技術(shù)成像深度局限于腦表層至淺層海馬區(qū)，無法覆蓋深層腦區(qū)。因此，研究人員將目光轉(zhuǎn)向內(nèi)窺鏡技術(shù)，期望通過植入微型探頭的熒光內(nèi)窺鏡開展活體深層腦功能調(diào)控研究。

基于GRIN透鏡的植入式內(nèi)窺活體腦成像
一、GRIN透鏡的特性及在活體腦成像中的應(yīng)用方式
GRIN透鏡折射率沿徑向漸變，使出射光線會(huì)聚成衍射極限光斑，具有直徑�。ㄍǔＰ∮�1mm）、結(jié)構(gòu)簡單、裝配方便、成本低和NA相對(duì)較大（不小于0.5）等優(yōu)點(diǎn)。在活體腦成像中，常將其作為植入式內(nèi)窺探頭，與普通顯微鏡或微型顯微鏡配合，增加工作距離，實(shí)現(xiàn)對(duì)深層NVU的高時(shí)空分辨內(nèi)窺成像。不過，成像時(shí)需吸除目標(biāo)腦區(qū)上層組織，且可能造成出血和炎癥反應(yīng)，因此目前主要用于嚙齒類動(dòng)物模型研究，實(shí)驗(yàn)通常在植入3-4周后進(jìn)行，以降低炎癥影響并進(jìn)行長期觀測。

二、基于GRIN透鏡的成像技術(shù)在腦科學(xué)研究中的具體應(yīng)用
1、血流動(dòng)力學(xué)與腦疾病研究
Jung等利用熒光素鈉標(biāo)記血漿，通過寬場顯微成像記錄小鼠和大鼠海馬體單個(gè)紅細(xì)胞在毛細(xì)血管中的流動(dòng)，發(fā)現(xiàn)腦部微血管血流速度減慢與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)，為深層腦區(qū)血流動(dòng)力學(xué)檢測提供新方向。

Barretto等對(duì)原位膠質(zhì)瘤小鼠模型進(jìn)行長期熒光內(nèi)窺成像，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長時(shí)周圍毛細(xì)血管直徑擴(kuò)大但血流速度降低，正常血管形態(tài)和錐體神經(jīng)元結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，這有助于理解腦膠質(zhì)瘤微環(huán)境重塑，展示了長期熒光內(nèi)窺技術(shù)在腦病模型研究中的價(jià)值。

2、神經(jīng)元調(diào)控行為機(jī)制研究
用于研究眶額皮層神經(jīng)元調(diào)控食物攝取行為、內(nèi)側(cè)杏仁核神經(jīng)元調(diào)控社交行為以及前內(nèi)側(cè)丘腦神經(jīng)元調(diào)控長期記憶等不同腦區(qū)神經(jīng)元調(diào)控動(dòng)物行為機(jī)制。

三、GRIN透鏡成像技術(shù)的優(yōu)化與發(fā)展
1、像差補(bǔ)償方法
商用GRIN透鏡存在像差，可通過多種方法校正。如增加平凸微透鏡、黏合帶有負(fù)球差的蓋玻片或在蓋玻片上3D打印非球面微透鏡，也可采用自適應(yīng)光學(xué)（AO）技術(shù)，如加州大學(xué)Ji教授團(tuán)隊(duì)將HiLo顯微技術(shù)引入寬場內(nèi)窺系統(tǒng)，利用AO校正模塊補(bǔ)償像差，提高了成像性能。

2、與雙光子成像技術(shù)結(jié)合
雙光子成像與GRIN透鏡結(jié)合可實(shí)現(xiàn)高分辨率軸掃描，無需移動(dòng)透鏡，且飛秒脈沖光在GRIN透鏡中色散小。Webb團(tuán)隊(duì)驗(yàn)證了其可行性，后續(xù)研究通過多種方法提高成像性能，如Moretti 等用SLM調(diào)制光場實(shí)現(xiàn)多焦點(diǎn)或圖案照明，Meng等將高斯光束調(diào)制成貝塞爾光束提高體成像速度，香港科技大學(xué)瞿佳男教授團(tuán)隊(duì)提出AO校正策略提升縱向深度分辨率，并利用快速電調(diào)諧透鏡實(shí)現(xiàn)多平面Ca2+信號(hào)同時(shí)成像。

3、微型顯微鏡的應(yīng)用
微型顯微鏡質(zhì)量輕，可在小動(dòng)物自由活動(dòng)時(shí)獲取NVU成像數(shù)據(jù)。將GRIN透鏡嵌入微型顯微鏡可實(shí)現(xiàn)內(nèi)窺腦成像，如Flusberg等設(shè)計(jì)的微型雙光子內(nèi)窺顯微鏡可實(shí)現(xiàn)海馬體以下約80μm的血管成像，Grewe等將GRIN透鏡與微型顯微鏡結(jié)合長期觀測神經(jīng)元Ca2+響應(yīng)，Barbera等在微型內(nèi)窺顯微鏡中添加可變焦液體透鏡研究不同深度神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)。

4、多區(qū)域成像方法
為研究跨腦區(qū)神經(jīng)元關(guān)聯(lián)性，發(fā)展了多種低成本成像方法。如Yang等設(shè)計(jì)的MATRIEX技術(shù)，通過多個(gè)GRIN透鏡實(shí)現(xiàn)不同腦區(qū)神經(jīng)元集群功能成像；Pochechuev等和Toader等將光纖束與GRIN透鏡裝配進(jìn)行內(nèi)窺腦成像，研究不同腦區(qū)神經(jīng)元集群關(guān)聯(lián)性，揭示了長期記憶鞏固受丘腦-皮層回路調(diào)控等機(jī)制。

基于單根多模光纖的植入式內(nèi)窺活體腦成像
一、多模光纖的特點(diǎn)及在活體內(nèi)窺腦成像中的原理
多模光纖能傳播多個(gè)光學(xué)模式，信息傳輸帶寬大，直徑極�。�50-125μm），插入腦組織時(shí)對(duì)周邊神經(jīng)元傷害小，可實(shí)現(xiàn)極微創(chuàng)內(nèi)窺腦成像。但不同光學(xué)模式在光纖中傳輸時(shí)存在模式色散、干涉和耦合，形成光學(xué)散斑，限制了其在高分辨率圖像傳輸和活體成像中的應(yīng)用。基于多模光纖的高分辨率內(nèi)窺成像通過傳輸矩陣測量和波前整形實(shí)現(xiàn)，利用光學(xué)調(diào)制器件調(diào)控光纖輸出光場，標(biāo)定傳輸矩陣控制入射波前實(shí)現(xiàn)光斑掃描，成像系統(tǒng)還包括光場調(diào)制、熒光成像、相機(jī)和參考光校正模塊。

二、多模光纖成像技術(shù)的發(fā)展歷程及性能提升措施
1、早期研究與思路驗(yàn)證
多模光纖成像方法雖早有報(bào)道，但早期受光纖加工工藝和工作環(huán)境影響，成像質(zhì)量不佳。2010年P(guān)opoff等的研究為高分辨成像提供思路，后續(xù)Bianchi等、Cizmar等不斷改進(jìn)，提高了成像速度和分辨率。

2、抗干擾與校準(zhǔn)方法

為克服外界干擾，提出多種方法，如引入虛擬信標(biāo)、在光纖遠(yuǎn)端加工部分反射器、超表面結(jié)構(gòu)或引導(dǎo)星，以及利用深度學(xué)習(xí)算法實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)校準(zhǔn)，如卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）等模型的應(yīng)用。

三、多模光纖成像技術(shù)在活體腦成像中的應(yīng)用成果
1、SLM調(diào)制成像
2018年Vasquez-Lopez等采用SLM調(diào)制實(shí)現(xiàn)活體大鼠背側(cè)紋狀體腦區(qū)神經(jīng)元三維成像，對(duì)腦組織損傷小，還可通過SLM隨機(jī)掃描研究Ca2+信號(hào)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，研究活體大鼠丘腦區(qū)接受聲音刺激后的Ca2+響應(yīng)。

2、DMD調(diào)制成像
DMD調(diào)制速率高，Turtaev等搭建的DMD多模光纖內(nèi)窺成像系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了較高成像速度和分辨率，可對(duì)視覺皮層和海馬體深層神經(jīng)元進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像；Shay等設(shè)計(jì)的雙色成像系統(tǒng)可捕捉快速傳導(dǎo)的Ca2+信號(hào)；Silveira等改進(jìn)的側(cè)視多模光纖實(shí)現(xiàn)了貫穿全腦的神經(jīng)元功能成像，浙江大學(xué)劉旭教授團(tuán)隊(duì)的技術(shù)實(shí)現(xiàn)了傳輸矩陣實(shí)時(shí)校準(zhǔn)，推動(dòng)了多模光纖內(nèi)窺成像技術(shù)的臨床應(yīng)用。

熒光內(nèi)窺腦成像技術(shù)在臨床上的應(yīng)用
一、在腦腫瘤術(shù)中診斷的具體應(yīng)用及優(yōu)勢
活體熒光內(nèi)窺腦成像技術(shù)在小動(dòng)物模型中成果顯著，在臨床腦腫瘤術(shù)中實(shí)時(shí)診斷方面發(fā)揮重要作用。神經(jīng)外科醫(yī)生借助帶有手持式探頭的內(nèi)窺鏡顯微鏡和熒光示蹤劑（如熒光素、吲哚菁綠和5-氨基乙酰丙酸等），可在微觀尺度上檢查腦組織中的腫瘤殘余，改善手術(shù)治療效果。如Charalampaki等展示了熒光內(nèi)窺成像技術(shù)在腦膜瘤手術(shù)中的應(yīng)用，Irakliy等搭建的術(shù)中遠(yuǎn)程病理學(xué)軟件平臺(tái)可實(shí)現(xiàn)高效術(shù)中決策。

二、熒光壽命顯微成像（FLIM）在臨床腦腫瘤手術(shù)中的探索性應(yīng)用
FLIM利用組織熒光壽命差異提供高對(duì)比度圖像，在臨床腦腫瘤手術(shù)中有初步探索性應(yīng)用，可輔助無標(biāo)記識(shí)別腫瘤組織。加州大學(xué)Marcu教授團(tuán)隊(duì)將FLIM內(nèi)窺系統(tǒng)與手術(shù)顯微鏡集成，通過監(jiān)測熒光壽命輔助醫(yī)生優(yōu)化手術(shù)方案，實(shí)現(xiàn)大面積腦腫瘤組織術(shù)中篩查。

總結(jié)與展望
植入式熒光內(nèi)窺顯微成像技術(shù)在腦科學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，已實(shí)現(xiàn)深層腦區(qū)的在體顯微成像。GRIN透鏡是常用光學(xué)元件，具有多種優(yōu)勢，適用于活體深層神經(jīng)元集群功能和血流動(dòng)力學(xué)研究；單根多模光纖成像技術(shù)雖新，但在特定需求研究中具有獨(dú)特優(yōu)勢�？裳兄颇Ｊ礁�穩(wěn)定、抗干擾能力強(qiáng)的多模光纖；采用精細(xì)3D打印技術(shù)在多模光纖端面上加工透鏡組，優(yōu)化成像分辨率、景深和視場；增加熒光偏振和熒光壽命成像模態(tài)，解析神經(jīng)元生理信息。隨著相關(guān)技術(shù)發(fā)展，熒光內(nèi)窺腦成像技術(shù)將取得新突破，推動(dòng)腦科學(xué)研究，助力疾病治療與預(yù)防。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：林方睿, 張晨爽, 連曉倩, 屈軍樂. 植入式熒光內(nèi)窺顯微技術(shù)及其在活體腦成像中的應(yīng)用（特邀）[J]. 中國激光, 2024, 51(1): 0107001. Fangrui Lin, Chenshuang Zhang, Xiaoqian Lian, Junle Qu. Implantable Fluorescence Endoscopic Microscopy and Its Application in In Vivo Brain Imaging (Invited)[J]. Chinese Journal of Lasers, 2024, 51(1): 0107001.