新型流式細胞術檢測基因轉移效率之法
一、引言
二、材料與方法
（一）細胞系與試劑
（一）細胞活率與膜標記 （二）基因轉移效率檢測
（一）細胞系與試劑
- 細胞系
本實驗選用常用的哺乳動物細胞系，如 HeLa 細胞（人宮頸癌細胞系）和 HEK293 細胞（人胚腎細胞系）作為基因轉移的受體細胞。這些細胞系具有生長迅速、易于培養(yǎng)和轉染等優(yōu)點，廣泛應用于基因轉移研究領域。 - 試劑
- 用于基因轉移的載體包括質粒 DNA（如綠色熒光蛋白（GFP）表達質粒）和病毒載體（如慢病毒載體），均購自知名生物試劑公司。
- 轉染試劑選用脂質體轉染試劑 Lipofectamine 2000，按照生產廠家提供的說明書進行操作。
- 熒光染料包括可特異性標記細胞膜的 DiI 染料（用于區(qū)分活細胞與死細胞）以及與外源基因表達產物特異性結合的熒光抗體（如抗 GFP 熒光抗體）。這些熒光染料均具有良好的光穩(wěn)定性和熒光特性，能夠滿足流式細胞術檢測的要求。
- 細胞培養(yǎng)
將 HeLa 細胞和 HEK293 細胞分別接種于含有 10% 胎牛血清、1% 青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，在 37°C、5% CO₂ 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。 - 轉染操作
- 對于質粒 DNA 轉染，將適量的質粒 DNA（如 GFP 表達質粒）與 Lipofectamine 2000 轉染試劑按照一定比例混合，在無血清培養(yǎng)基中孵育形成轉染復合物。然后將轉染復合物加入到細胞培養(yǎng)皿中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間（通常為 24 - 48 小時）。
- 對于病毒載體轉導，將慢病毒載體與適量的病毒包裝輔助質粒共轉染到包裝細胞系（如 293T 細胞）中，收集病毒上清液并濃縮。將濃縮后的病毒液按照一定的感染復數(shù)（MOI）加入到目標細胞培養(yǎng)皿中，同時加入聚凝胺以增強病毒感染效率，培養(yǎng) 48 - 72 小時后進行檢測。
- 細胞樣本制備
- 在轉染或轉導后的不同時間點，收集細胞，用預冷的 PBS 緩沖液洗滌細胞兩次，以去除培養(yǎng)基中的雜質和未轉染的質�；虿《绢w粒。
- 將細胞重懸于適量的 PBS 緩沖液中，加入 DiI 染料，按照 1:1000 的比例稀釋，在 4°C 下避光孵育 15 - 30 分鐘，以標記細胞膜。然后用 PBS 緩沖液再次洗滌細胞，去除未結合的 DiI 染料。
- 對于表達 GFP 的細胞，直接將細胞懸液進行流式細胞儀檢測；對于其他外源基因表達的細胞，加入相應的熒光抗體，按照 1:500 的比例稀釋，在 4°C 下避光孵育 30 - 60 分鐘，然后用 PBS 緩沖液洗滌細胞，去除未結合的熒光抗體。
- 流式細胞儀檢測參數(shù)設置
- 使用 FACSVerse 流式細胞儀（BD Biosciences）進行檢測。首先，通過前向散射光（FSC）和側向散射光（SSC）對細胞群體進行初步篩選，排除細胞碎片和聚集物。
- 設置 DiI 染料的熒光檢測通道（如 FL3 通道），檢測細胞膜的熒光信號，以區(qū)分活細胞與死細胞。對于 GFP 或其他熒光標記的外源基因表達產物，分別設置相應的熒光檢測通道（如 FL1 通道用于 GFP），調整合適的電壓和補償參數(shù)，以確保能夠準確檢測到熒光信號并排除背景干擾。
- 采用雙參數(shù)或多參數(shù)分析模式，同時檢測細胞的熒光強度和細胞數(shù)量，以獲取細胞群體中不同熒光強度亞群的分布情況。
- 數(shù)據(jù)采集
使用流式細胞儀配套的軟件（如 BD FACSDiva 軟件）采集細胞的熒光信號數(shù)據(jù)，包括每個細胞的熒光強度、細胞數(shù)量以及不同熒光通道之間的相關性等信息。 - 數(shù)據(jù)分析
- 將采集到的數(shù)據(jù)導入到專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件（如 FlowJo）中進行進一步分析。首先，通過繪制熒光強度直方圖，確定熒光陽性細胞的比例，即表達外源基因的細胞占總細胞數(shù)的百分比，作為基因轉移效率的初步評估指標。
- 采用雙變量或多變量分析方法，分析不同熒光通道之間的相關性，例如 DiI 與 GFP 熒光強度之間的關系，以排除非特異性熒光信號的干擾，提高檢測的準確性。
- 對于多組實驗數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計學分析方法（如 t 檢驗或方差分析）比較不同實驗組之間基因轉移效率的差異，以評估不同轉染或轉導條件對基因轉移效率的影響。
（一）細胞活率與膜標記 （二）基因轉移效率檢測
- 質粒 DNA 轉染
以 GFP 表達質粒轉染 HeLa 細胞和 HEK293 細胞為例，在轉染 24 小時后，通過流式細胞術檢測到表達 GFP 的細胞群體。在 HeLa 細胞中，GFP 陽性細胞比例約為 30% - 40%，而在 HEK293 細胞中，GFP 陽性細胞比例相對較高，可達 50% - 60%。隨著轉染時間的延長至 48 小時，GFP 陽性細胞比例在兩種細胞系中均有所增加，表明基因表達水平逐漸升高。 - 病毒載體轉導
使用慢病毒載體轉導 HeLa 細胞和 HEK293 細胞時，在轉導 48 小時后即可檢測到較高比例的外源基因表達細胞。以某一特定外源基因（非 GFP）為例，通過熒光抗體標記后，在 HeLa 細胞中，該外源基因陽性細胞比例約為 40% - 50%，在 HEK293 細胞中可達 60% - 70%。與質粒 DNA 轉染相比，病毒載體轉導在基因轉移效率方面表現(xiàn)出更高的效率和更穩(wěn)定的表達水平。
- 準確性驗證
為了驗證新型流式細胞術檢測方法的準確性，將本方法與傳統(tǒng)的 qPCR 方法進行對比。在對同一批轉染細胞樣本進行檢測時，兩種方法所測得的基因轉移效率結果具有良好的相關性（R² > 0.9）。然而，本方法能夠直接反映細胞水平的基因表達情況，而 qPCR 方法檢測的是基因轉錄水平，可能存在轉錄后調控等因素導致的差異。 - 靈敏度評估
通過對低表達水平的外源基因進行檢測，評估新型流式細胞術檢測方法的靈敏度。結果表明，該方法能夠檢測到低至 1% - 2% 的熒光陽性細胞，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)流式細胞術檢測方法（通常最低檢測限為 5% - 10%），能夠更靈敏地檢測到低表達水平的基因轉移事件。
- 轉染試劑濃度
在質粒 DNA 轉染實驗中，研究了不同濃度的 Lipofectamine 2000 轉染試劑對基因轉移效率的影響。結果顯示，隨著轉染試劑濃度的增加，基因轉移效率呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。當轉染試劑濃度過高時，可能會對細胞產生毒性作用，導致細胞死亡和基因轉移效率下降。 - 病毒感染復數(shù)（MOI）
在病毒載體轉導實驗中，改變慢病毒載體的 MOI 值，觀察其對基因轉移效率的影響。隨著 MOI 值的增加，外源基因陽性細胞比例逐漸升高，但當 MOI 值過高時，可能會出現(xiàn)病毒載體的過度感染，導致細胞狀態(tài)異常和基因表達不穩(wěn)定。
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