基因槍法介導 GUS 基因轉入煙草脫外壁花粉的瞬時表達研究
一、引言
二、材料與方法
（一）植物材料 （二）脫外壁花粉的制備
（一）脫外壁花粉的形態(tài)觀察 （二）基因槍轉化后 GUS 基因的瞬時表達
（一）脫外壁花粉在基因轉化中的優(yōu)勢 （二）基因槍法在花粉轉化中的應用 （三）GUS 基因作為報告基因的有效性 （四）研究的應用前景 五、結論
（一）植物材料 （二）脫外壁花粉的制備
- 采集處于單核靠邊期的煙草花蕾，用 70% 乙醇表面消毒 30 s，再用 0.1% HgCl₂消毒 8 - 10 min，然后用無菌水沖洗 3 - 4 次。
- 將消毒后的花蕾在無菌條件下取出花藥，置于含有 10% 蔗糖、0.01% 硼酸、0.5% 纖維素酶和 0.2% 果膠酶的酶解液中，在 28°C、黑暗條件下酶解 2 - 3 h。
- 酶解結束后，通過 40 μm 濾網過濾除去雜質，收集花粉，用 15% 蔗糖溶液離心洗滌 2 - 3 次，得到脫外壁花粉，將其懸浮于適量的轉化緩沖液中備用。
- 質粒構建
構建含有 GUS 基因的植物表達質粒，該質粒以 CaMV 35S 為啟動子驅動 GUS 基因的表達，并含有篩選標記基因（如潮霉素抗性基因）。 - 金粉準備
稱取 60 mg 直徑為 1.0 μm 的金粉，懸浮于 1 mL 無水乙醇中，振蕩混勻后離心收集金粉，用無菌水洗滌 2 - 3 次，最后將金粉重新懸浮于 1 mL 無菌水中，備用。 - 微彈制備
取 50 μL 金粉懸浮液，依次加入 10 μL 質粒 DNA（濃度為 1 μg/μL）、50 μL 2.5 M CaCl₂和 20 μL 0.1 M 亞精胺，振蕩混勻后靜置 10 min，離心收集沉淀，用 70% 乙醇和無水乙醇各洗滌一次，最后將沉淀重新懸浮于 60 μL 無水乙醇中。 - 基因槍射擊
將適量的脫外壁花粉均勻涂布于培養(yǎng)皿中的固體培養(yǎng)基表面，待花粉稍干燥后，將制備好的微彈用基因槍（Bio - Rad PDS - 1000/He）按照設定的參數（如氦氣壓力 1100 psi、真空度 28 inHg、射擊距離 6 cm 等）進行射擊。
- 組織化學染色
在基因槍轉化后 24 - 48 h，取部分轉化后的花粉，加入 GUS 染色液（含有 1 mM X - Gluc、50 mM 磷酸鈉緩沖液 pH 7.0、0.5 mM 鐵氰化鉀、0.5 mM 亞鐵氰化鉀、0.1% Triton X - 100），在 37°C 黑暗條件下染色 2 - 4 h。染色結束后，用 70% 乙醇脫色，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計藍色染色的花粉數量，以計算 GUS 基因的瞬時表達率。 - 熒光定量分析
提取轉化后花粉的總 RNA，反轉錄合成 cDNA。以煙草 Actin 基因作為內參基因，設計 GUS 基因和 Actin 基因的特異性引物，采用實時熒光定量 PCR 技術檢測 GUS 基因的相對表達量。反應體系按照 SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒說明書進行配制，在熒光定量 PCR 儀上進行擴增反應，反應條件為：95°C 預變性 3 min；95°C 變性 10 s，60°C 退火 30 s，72°C 延伸 30 s，共 40 個循環(huán)。根據擴增曲線和熔解曲線分析數據，計算 GUS 基因相對表達量。
（一）脫外壁花粉的形態(tài)觀察 （二）基因槍轉化后 GUS 基因的瞬時表達
- 組織化學染色結果
通過 GUS 組織化學染色，在基因槍轉化后的花粉中觀察到部分花粉呈現藍色，表明 GUS 基因在這些花粉中得到了表達。未轉化的對照花粉則無藍色出現。統(tǒng)計不同處理組中藍色花粉的數量，計算得到 GUS 基因的瞬時表達率在不同條件下有所差異，范圍為 5% - 25%。 - 熒光定量分析結果
熒光定量 PCR 結果顯示，轉化后的花粉中 GUS 基因的相對表達量明顯高于未轉化的對照花粉。不同轉化條件下 GUS 基因的相對表達量變化趨勢與組織化學染色得到的瞬時表達率基本一致，進一步證實了 GUS 基因在煙草脫外壁花粉中的成功導入和表達。
（一）脫外壁花粉在基因轉化中的優(yōu)勢 （二）基因槍法在花粉轉化中的應用 （三）GUS 基因作為報告基因的有效性 （四）研究的應用前景 五、結論
