應(yīng)用直接分化再生系統(tǒng)開展亞麻轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究
一、引言
二、材料與方法
（一）植物材料 （二）培養(yǎng)基配制
（一）直接分化再生體系的建立
（一）植物材料 （二）培養(yǎng)基配制
- 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基：以 MS 基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加不同濃度的生長素（如 2,4 - D）和細(xì)胞分裂素（如 6 - BA），以及適量的蔗糖和瓊脂，調(diào)節(jié) pH 值至 5.8 左右。通過設(shè)置不同濃度梯度組合，篩選出最適合亞麻愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基配方。
- 直接分化培養(yǎng)基：在 MS 培養(yǎng)基中加入特定比例的植物生長調(diào)節(jié)劑，如低濃度的生長素與較高濃度的細(xì)胞分裂素，同時(shí)補(bǔ)充必要的有機(jī)營養(yǎng)成分和微量元素，以促進(jìn)外植體直接分化出芽。
- 生根培養(yǎng)基：采用 1/2 MS 培養(yǎng)基，添加適量的生長素（如 NAA），促進(jìn)轉(zhuǎn)基因苗生根。
- 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法
- 構(gòu)建含有目的基因（如抗蟲基因或品質(zhì)改良相關(guān)基因）的農(nóng)桿菌工程菌株。將活化后的農(nóng)桿菌接種到含有相應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。
- 把預(yù)培養(yǎng)一定時(shí)間的亞麻外植體浸入農(nóng)桿菌菌液中，浸泡時(shí)間為 10 - 20 分鐘，然后用無菌濾紙吸干多余菌液，轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，共培養(yǎng) 2 - 3 天。共培養(yǎng)后，將外植體轉(zhuǎn)移至含有抗生素（用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞）的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和篩選。
- 基因槍法
- 制備包裹有目的基因的金粉或鎢粉微粒。將目的基因與微粒混合，加入適量的緩沖液和表面活性劑，充分混勻后進(jìn)行微粒的包被處理。
- 利用基因槍將包被有目的基因的微粒高速射入亞麻外植體組織中。設(shè)置合適的基因槍參數(shù)，如壓力、射程等，以確保微粒能夠有效穿透外植體細(xì)胞壁并將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。射擊后的外植體在無菌條件下培養(yǎng)一段時(shí)間后，轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行后續(xù)篩選培養(yǎng)。
- 抗生素篩選：在愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)過程中，利用培養(yǎng)基中添加的抗生素（如卡那霉素或潮霉素）對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行篩選。只有成功導(dǎo)入目的基因并表達(dá)相應(yīng)抗生素抗性基因的細(xì)胞才能在篩選培養(yǎng)基上正常生長發(fā)育，形成愈傷組織并分化出芽和根。
- 分子檢測
- PCR 檢測：提取轉(zhuǎn)基因植株的基因組 DNA，利用特異性引物對(duì)目的基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的有無及大小，初步判斷目的基因是否整合到亞麻基因組中。
- Southern 雜交：對(duì)于 PCR 檢測陽性的植株，進(jìn)一步進(jìn)行 Southern 雜交分析。將基因組 DNA 進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，電泳分離后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，與標(biāo)記的目的基因探針進(jìn)行雜交。通過雜交信號(hào)的強(qiáng)弱和位置，確定目的基因在基因組中的整合拷貝數(shù)和整合位點(diǎn)。
- RT - PCR 檢測：提取轉(zhuǎn)基因植株的總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，然后利用目的基因特異性引物進(jìn)行 RT - PCR 擴(kuò)增。通過檢測目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，分析目的基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)活性。
（一）直接分化再生體系的建立
- 外植體對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響
不同外植體在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的反應(yīng)存在差異。子葉外植體在接種后 3 - 5 天開始出現(xiàn)輕微膨大，7 - 10 天逐漸形成淡黃色的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá) 60% - 70%；下胚軸外植體則在接種后 5 - 7 天開始有反應(yīng)，誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地相對(duì)較硬，誘導(dǎo)率約為 50% - 60%。在直接分化培養(yǎng)基上，子葉愈傷組織經(jīng)過 10 - 15 天培養(yǎng)開始分化出芽點(diǎn)，芽分化率約為 30% - 40%；下胚軸愈傷組織芽分化相對(duì)較晚，需要 15 - 20 天，芽分化率在 20% - 30%。 - 培養(yǎng)基配方對(duì)再生的影響
通過對(duì)不同濃度生長素和細(xì)胞分裂素組合的篩選，發(fā)現(xiàn)當(dāng)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中 2,4 - D 濃度為 1.0 - 2.0 mg/L，6 - BA 濃度為 0.5 - 1.0 mg/L 時(shí)，愈傷組織誘導(dǎo)效果較好；在直接分化培養(yǎng)基中，當(dāng) 6 - BA 濃度為 2.0 - 3.0 mg/L，NAA 濃度為 0.1 - 0.2 mg/L 時(shí)，芽分化效率顯著提高，芽分化率可達(dá)到 40% - 50%。生根培養(yǎng)基中 NAA 濃度為 0.5 - 1.0 mg/L 時(shí)，轉(zhuǎn)基因苗生根狀況良好，生根率可達(dá) 80% 以上。
- 農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法
經(jīng)過對(duì)農(nóng)桿菌菌液濃度、侵染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間等因素的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)農(nóng)桿菌菌液 OD600 值為 0.5 - 0.8，侵染時(shí)間為 15 分鐘，共培養(yǎng)時(shí)間為 2 天時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較高。通過抗生素篩選和分子檢測，獲得了一批轉(zhuǎn)基因植株。PCR 檢測結(jié)果顯示，約 30% - 40% 的抗性植株中檢測到目的基因的特異性擴(kuò)增條帶；Southern 雜交結(jié)果表明，目的基因在轉(zhuǎn)基因植株基因組中的整合拷貝數(shù)為 1 - 3 個(gè)不等，整合位點(diǎn)較為隨機(jī)。 - 基因槍法
基因槍法轉(zhuǎn)化過程中，當(dāng)金粉微粒直徑為 1.0 - 1.5 μm，基因槍壓力為 1100 - 1300 psi，射程為 6 - 9 cm 時(shí)，能夠獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。經(jīng)篩選和檢測，基因槍法轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植株獲得率相對(duì)較低，約為 10% - 20%，但目的基因整合較為穩(wěn)定，多數(shù)轉(zhuǎn)基因植株中目的基因以單拷貝形式整合到基因組中。
- 分子檢測結(jié)果
對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行 RT - PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平有明顯表達(dá)，表達(dá)量與目的基因的功能特性和整合位點(diǎn)有關(guān)。在抗蟲基因轉(zhuǎn)基因植株中，表達(dá)量較高的植株在人工接蟲試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蟲性，葉片受損程度明顯低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辍?/li> - 表型分析結(jié)果
在生長發(fā)育方面，部分轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甏嬖谝欢ú町悺Ｒ恍┺D(zhuǎn)基因植株的株高略有增加，莖粗變粗，葉片數(shù)量和葉面積也有所增大，可能與導(dǎo)入的生長調(diào)節(jié)相關(guān)基因有關(guān)。在品質(zhì)分析方面，如油脂含量改良基因轉(zhuǎn)基因植株，其種子中的油脂含量較非轉(zhuǎn)基因植株提高了 10% - 15%，同時(shí)脂肪酸組成也發(fā)生了一定變化，不飽和脂肪酸含量有所增加，這對(duì)于提高亞麻油的營養(yǎng)價(jià)值具有重要意義。
標(biāo)簽：
分子雜交儀、原位雜交儀、紫外交聯(lián)儀
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