一、引言
大豆（Glycine max (L.) Merr.）作為全球重要的糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物，在油脂、蛋白質(zhì)生產(chǎn)以及動(dòng)物飼料等方面具有廣泛應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對大豆進(jìn)行遺傳改良已成為提高大豆產(chǎn)量、品質(zhì)以及增強(qiáng)其抗逆性的重要手段。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化是目前應(yīng)用較為廣泛且有效的大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法之一，其具有轉(zhuǎn)化效率相對較高、可導(dǎo)入較大片段外源 DNA 且遺傳穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)。然而，該方法仍存在一些技術(shù)瓶頸，如轉(zhuǎn)化效率受多種因素制約、不同大豆品種之間轉(zhuǎn)化效率差異較大等。此外，轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)引發(fā)了廣泛的關(guān)注與爭議，涉及食品安全、生態(tài)環(huán)境安全以及社會經(jīng)濟(jì)等多方面問題。因此，深入研究農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)展以及全面了解轉(zhuǎn)基因作物現(xiàn)狀具有重要的科學(xué)意義與現(xiàn)實(shí)意義。
二、農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化方法
（一）外植體的選擇與預(yù)處理
- 外植體類型
大豆的多種外植體可用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，其中子葉節(jié)、胚尖、未成熟子葉等較為常用。子葉節(jié)具有再生能力較強(qiáng)、易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用最為廣泛的外植體類型。胚尖則具有較高的分化潛能，在一些研究中也能獲得較好的轉(zhuǎn)化效果。未成熟子葉在特定的培養(yǎng)條件下也可誘導(dǎo)出再生植株，但對取材時(shí)間要求較為嚴(yán)格。
- 預(yù)處理方法
在農(nóng)桿菌感染前，對外植體進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理有助于提高轉(zhuǎn)化效率。例如，將子葉節(jié)在含特定激素的培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂和組織的敏感性，使外植體更易接受農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。同時(shí)，對外植體進(jìn)行表面消毒處理以去除微生物污染也是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，常用的消毒劑有次氯酸鈉、氯化汞等，但需要嚴(yán)格控制消毒時(shí)間和濃度，以避免對外植體造成過度傷害。
（二）農(nóng)桿菌菌株與載體構(gòu)建
- 農(nóng)桿菌菌株
不同的農(nóng)桿菌菌株對大豆的轉(zhuǎn)化效率存在差異。常用的農(nóng)桿菌菌株有根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）的 LBA4404、EHA105 等。這些菌株攜帶不同的 Ti 質(zhì)粒，其 Vir 基因的活性以及對植物細(xì)胞的侵染能力有所不同。例如，EHA105 菌株的 Vir 基因活性相對較高，在某些大豆品種的轉(zhuǎn)化中表現(xiàn)出較好的效果。
- 載體構(gòu)建
構(gòu)建合適的載體是實(shí)現(xiàn)外源基因成功導(dǎo)入大豆細(xì)胞的關(guān)鍵。載體通常包含 T - DNA 邊界序列，在邊界序列之間插入目的基因、篩選標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因或除草劑抗性基因）以及啟動(dòng)子、終止子等調(diào)控元件。啟動(dòng)子的選擇對目的基因的表達(dá)水平有重要影響，常用的啟動(dòng)子有 CaMV 35S 啟動(dòng)子、Ubiquitin 啟動(dòng)子等。此外，為了提高轉(zhuǎn)化效率和目的基因的整合穩(wěn)定性，還可在載體中添加一些增強(qiáng)元件或核定位信號序列等。
（三）共培養(yǎng)條件
- 共培養(yǎng)時(shí)間
農(nóng)桿菌與大豆外植體的共培養(yǎng)時(shí)間是影響轉(zhuǎn)化效率的重要因素之一。共培養(yǎng)時(shí)間過短，農(nóng)桿菌可能無法充分將 T - DNA 轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中；共培養(yǎng)時(shí)間過長，則容易導(dǎo)致農(nóng)桿菌過度生長，對外植體產(chǎn)生毒害作用，同時(shí)增加了外植體污染的風(fēng)險(xiǎn)。一般來說，子葉節(jié)與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)時(shí)間在 2 - 3 天較為合適，但不同的大豆品種和實(shí)驗(yàn)條件可能需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)膬?yōu)化調(diào)整。
- 共培養(yǎng)溫度與光照
共培養(yǎng)溫度通常控制在 22 - 25°C 之間，在此溫度范圍內(nèi)，農(nóng)桿菌的生長和 T - DNA 轉(zhuǎn)移活性相對較高，同時(shí)大豆外植體的生理狀態(tài)也較為適宜。光照條件對共培養(yǎng)過程也有一定影響，一般在弱光或黑暗條件下進(jìn)行共培養(yǎng)，可減少外植體的光氧化損傷，并有利于農(nóng)桿菌的侵染過程。
（四）篩選與再生體系
- 篩選標(biāo)記基因的選擇與應(yīng)用
篩選標(biāo)記基因用于在轉(zhuǎn)化過程中篩選出成功導(dǎo)入外源基因的細(xì)胞或組織。抗生素抗性基因（如卡那霉素抗性基因）和除草劑抗性基因（如草甘膦抗性基因）是常用的篩選標(biāo)記基因。在共培養(yǎng)后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有相應(yīng)篩選劑的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織由于無法抵抗篩選劑的作用而死亡，轉(zhuǎn)化成功的則能夠繼續(xù)生長發(fā)育。
- 再生體系的建立
建立高效的再生體系是獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株的關(guān)鍵步驟。再生體系包括愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化和根形成等階段。在愈傷組織誘導(dǎo)階段，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的激素種類和濃度（如添加生長素和細(xì)胞分裂素），促使外植體形成愈傷組織。然后，在芽分化培養(yǎng)基上，調(diào)整激素比例，誘導(dǎo)愈傷組織分化出芽。最后，將分化出的芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，使其生根形成完整的轉(zhuǎn)基因植株。不同大豆品種的再生能力不同，因此需要針對具體品種優(yōu)化再生培養(yǎng)基的配方和培養(yǎng)條件。
三、影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的因素
（一）大豆基因型
不同大豆基因型在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中表現(xiàn)出顯著的差異。這種差異主要體現(xiàn)在外植體的再生能力、對農(nóng)桿菌侵染的敏感性以及與外源基因整合的效率等方面。一些大豆品種具有較強(qiáng)的再生能力和較高的轉(zhuǎn)化效率，如 “Jack” 等品種，而另一些品種則較難轉(zhuǎn)化，如某些地方品種或野生大豆資源�；蛐筒町惪赡芘c大豆細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、內(nèi)源激素水平、基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等多種因素有關(guān)。因此，在進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究時(shí)，選擇合適基因型的大豆材料對于提高轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要。
（二）農(nóng)桿菌菌株與載體因素
除了上述提到的農(nóng)桿菌菌株和載體構(gòu)建對轉(zhuǎn)化效率的影響外，農(nóng)桿菌的濃度、載體的拷貝數(shù)以及 T - DNA 的結(jié)構(gòu)等也會影響轉(zhuǎn)化效果。適宜的農(nóng)桿菌濃度能夠保證在不對外植體造成過度傷害的前提下，實(shí)現(xiàn)有效的 T - DNA 轉(zhuǎn)移。載體拷貝數(shù)過高可能導(dǎo)致 T - DNA 整合的不穩(wěn)定性或引起基因沉默現(xiàn)象。此外，T - DNA 的邊界序列完整性、插入片段的大小和序列特征等都會對其在大豆基因組中的整合效率和表達(dá)水平產(chǎn)生影響。
（三）培養(yǎng)條件與環(huán)境因素
培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基的成分（包括碳源、氮源、無機(jī)鹽、維生素等）、pH 值、滲透壓等對大豆外植體的生長發(fā)育和農(nóng)桿菌的侵染過程都有重要作用。例如，培養(yǎng)基中適當(dāng)增加蔗糖濃度可以調(diào)節(jié)滲透壓，有利于外植體的生長和轉(zhuǎn)化，但過高的蔗糖濃度可能會抑制細(xì)胞分裂和分化。環(huán)境因素如光照強(qiáng)度、光照時(shí)間、溫度和濕度等也不容忽視。在轉(zhuǎn)化過程中，保持穩(wěn)定的環(huán)境條件，避免溫度和濕度的劇烈波動(dòng)，有助于提高轉(zhuǎn)化效率的穩(wěn)定性。
四、轉(zhuǎn)基因大豆在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀
（一）抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆
抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆主要通過導(dǎo)入來自蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）的殺蟲蛋白基因，使其表達(dá)產(chǎn)生對害蟲具有毒性的蛋白，從而有效抵御大豆害蟲的侵害，如大豆食心蟲、棉鈴蟲等。種植抗蟲轉(zhuǎn)基因大豆能夠顯著減少化學(xué)殺蟲劑的使用量，降低生產(chǎn)成本，同時(shí)減少農(nóng)藥對環(huán)境的污染和對非靶標(biāo)生物的危害，有利于農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展。
（二）抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆
抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆是目前全球種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因大豆類型。通過導(dǎo)入抗除草劑基因，如草甘膦抗性基因，使大豆植株能夠在噴施除草劑的田間環(huán)境中正常生長，而雜草則被有效清除。這大大簡化了田間除草作業(yè)，提高了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率，同時(shí)也有利于推廣免耕或少耕等農(nóng)業(yè)耕作方式，減少土壤侵蝕和水土流失。
（三）品質(zhì)改良轉(zhuǎn)基因大豆
為了滿足不同的市場需求，研究人員還致力于通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)改良大豆的品質(zhì)。例如，通過調(diào)控大豆種子中脂肪酸的合成途徑，改變脂肪酸的組成和含量，提高大豆油的營養(yǎng)價(jià)值，如增加不飽和脂肪酸（如油酸）的比例，降低飽和脂肪酸的含量。此外，還可以通過基因工程手段提高大豆種子中的蛋白質(zhì)含量和質(zhì)量，改善其氨基酸組成，使其更符合人類和動(dòng)物的營養(yǎng)需求。
五、轉(zhuǎn)基因作物面臨的爭議與挑戰(zhàn)
（一）食品安全問題
轉(zhuǎn)基因作物的食品安全是公眾最為關(guān)注的問題之一。主要擔(dān)憂包括轉(zhuǎn)基因作物可能產(chǎn)生新的過敏原、毒性物質(zhì)或營養(yǎng)成分改變等。雖然大量的科學(xué)研究表明，經(jīng)過嚴(yán)格審批上市的轉(zhuǎn)基因作物與傳統(tǒng)作物在食品安全方面具有實(shí)質(zhì)等同性，但公眾對轉(zhuǎn)基因食品的疑慮仍然存在。因此，需要進(jìn)一步加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物食品安全評價(jià)體系的建設(shè)，開展長期、多代的動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)以及深入的成分分析和毒理學(xué)研究，以確保轉(zhuǎn)基因食品的安全性。
（二）生態(tài)環(huán)境安全問題
轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)環(huán)境的潛在影響也是爭議的焦點(diǎn)。例如，轉(zhuǎn)基因作物可能通過花粉傳播將外源基因漂移到野生近緣種中，導(dǎo)致野生植物種群基因庫的改變，進(jìn)而影響生態(tài)平衡。此外，抗蟲轉(zhuǎn)基因作物可能對非靶標(biāo)生物產(chǎn)生影響，如影響有益昆蟲的生存和繁衍，改變農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性。因此，在轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)和推廣過程中，需要進(jìn)行全面的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評估，制定相應(yīng)的監(jiān)測和管理措施，以降低其對生態(tài)環(huán)境的潛在風(fēng)險(xiǎn)。
（三）社會經(jīng)濟(jì)問題
轉(zhuǎn)基因作物的推廣還涉及一系列社會經(jīng)濟(jì)問題。一方面，轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要由少數(shù)大型跨國公司掌握，這可能導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的技術(shù)壟斷，使發(fā)展中國家在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域處于劣勢地位，加劇全球農(nóng)業(yè)發(fā)展的不平衡。另一方面，轉(zhuǎn)基因作物的種植可能對傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式和農(nóng)民的生計(jì)產(chǎn)生影響，如導(dǎo)致部分傳統(tǒng)農(nóng)產(chǎn)品市場份額下降，農(nóng)民收入減少等。因此，需要建立合理的政策法規(guī)和利益分配機(jī)制，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因技術(shù)的公平應(yīng)用和全球農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
六、結(jié)論與展望
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在過去幾十年中取得了顯著的進(jìn)展，為大豆的遺傳改良提供了有力的工具。通過不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法、深入研究影響轉(zhuǎn)化效率的因素以及拓展轉(zhuǎn)基因大豆的應(yīng)用領(lǐng)域，有望進(jìn)一步提高大豆的產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性，滿足全球日益增長的糧食和飼料需求。然而，轉(zhuǎn)基因作物在發(fā)展過程中面臨著諸多爭議與挑戰(zhàn)，需要科學(xué)界、政府部門、企業(yè)和公眾共同努力，加強(qiáng)溝通與合作。在未來的研究中，應(yīng)進(jìn)一步完善轉(zhuǎn)基因作物的安全評價(jià)體系，深入開展轉(zhuǎn)基因作物對生態(tài)環(huán)境和社會經(jīng)濟(jì)影響的研究，制定科學(xué)合理的政策法規(guī)，推動(dòng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的安全、可持續(xù)應(yīng)用，為保障全球糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展做出更大的貢獻(xiàn)。
