核酸雜交技術(shù)于環(huán)境微生物研究之應(yīng)用
瀏覽次數(shù)：164 發(fā)布日期：2024-11-21
來源：威尼德生物科技
一、引言
環(huán)境微生物在地球生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)化和生態(tài)平衡維持中起著至關(guān)重要的作用。它們參與了土壤肥力的形成、水體自凈過程、大氣成分的調(diào)節(jié)以及生物地球化學(xué)循環(huán)等眾多關(guān)鍵生態(tài)過程。然而，環(huán)境微生物具有高度的多樣性和復(fù)雜性，其種類繁多、豐度差異大且分布廣泛，傳統(tǒng)的微生物研究方法在解析環(huán)境微生物群落組成、功能和動態(tài)變化方面存在一定的局限性。
核酸雜交技術(shù)作為一種分子生物學(xué)手段，能夠基于核酸分子的互補配對原理，特異性地檢測和分析環(huán)境樣品中的微生物核酸序列，從而為深入了解環(huán)境微生物的生態(tài)特征提供了有力工具。該技術(shù)具有高度的特異性和靈敏性，能夠在復(fù)雜的環(huán)境樣品中準確識別目標微生物或其特定基因序列，在環(huán)境微生物研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用并取得了顯著的成果。
二、核酸雜交技術(shù)原理
核酸雜交是基于兩條互補的單鏈核酸分子在適宜條件下通過堿基互補配對形成雙鏈結(jié)構(gòu)的原理。在環(huán)境微生物研究中，通常是將已知序列的核酸探針（通常是一段標記的單鏈 DNA 或 RNA）與環(huán)境樣品中提取的總核酸（包括 DNA 和 RNA）進行雜交反應(yīng)。如果樣品中存在與探針互補的核酸序列，探針就會與其特異性結(jié)合形成雙鏈雜交體。通過檢測雜交體的形成與否以及雜交信號的強度，可以獲取關(guān)于目標微生物或基因在環(huán)境樣品中的存在、豐度和分布等信息。
根據(jù)雜交對象和實驗操作方式的不同，核酸雜交技術(shù)可分為多種類型，主要包括 Southern 雜交、Northern 雜交、原位雜交等。
（一）Southern 雜交
Southern 雜交主要用于檢測環(huán)境樣品中的特定 DNA 序列。其基本步驟如下：首先，從環(huán)境樣品中提取總 DNA，然后使用限制性內(nèi)切酶對提取的 DNA 進行切割，將其切成大小不同的片段。接著，通過瓊脂糖凝膠電泳將這些片段按照分子量大小進行分離，電泳結(jié)束后將 DNA 片段轉(zhuǎn)移到固相支持物（如硝酸纖維素膜或尼龍膜）上。之后，將標記有放射性同位素或非放射性標記物（如地高辛、生物素等）的核酸探針與膜上的 DNA 片段進行雜交反應(yīng)。雜交完成后，去除未雜交的探針，通過檢測雜交信號來確定目標 DNA 序列在樣品中的存在和位置。放射性同位素標記的探針可通過放射自顯影檢測雜交信號，非放射性標記物則可通過相應(yīng)的免疫檢測或化學(xué)顯色反應(yīng)進行檢測。
（二）Northern 雜交
Northern 雜交與 Southern 雜交類似，但主要用于檢測環(huán)境樣品中的特定 RNA 序列。其操作流程首先是從環(huán)境樣品中提取總 RNA，然后將 RNA 進行變性電泳分離，通常采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳。電泳后將 RNA 轉(zhuǎn)移至固相支持物上，再與標記的核酸探針進行雜交反應(yīng)，最后檢測雜交信號。Northern 雜交可用于研究環(huán)境微生物中特定基因的表達情況，通過檢測不同環(huán)境條件下目標 RNA 的豐度變化，了解微生物基因表達的調(diào)控機制以及微生物對環(huán)境變化的響應(yīng)。
（三）原位雜交
原位雜交是在保持微生物細胞或組織形態(tài)完整的基礎(chǔ)上，直接對細胞內(nèi)的核酸序列進行雜交檢測。該技術(shù)能夠確定特定微生物在環(huán)境樣品中的空間分布和豐度情況。具體操作時，先將環(huán)境樣品進行固定和處理，使細胞通透性增加，以便探針能夠進入細胞內(nèi)與目標核酸雜交。然后加入標記的核酸探針進行雜交反應(yīng)，雜交后去除未結(jié)合的探針，根據(jù)標記物的性質(zhì)進行檢測，如使用熒光標記的探針可通過熒光顯微鏡直接觀察細胞內(nèi)的雜交信號，從而確定目標微生物在樣品中的位置和數(shù)量。
三、核酸雜交技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用
（一）環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)分析
- 群落組成多樣性評估
利用核酸雜交技術(shù)可以設(shè)計針對不同微生物類群的通用探針或特異性探針，對環(huán)境樣品中的總核酸進行雜交分析。通過檢測多種探針的雜交信號，可以了解環(huán)境微生物群落中不同微生物類群的相對豐度和分布情況，從而評估群落的組成多樣性。例如，針對細菌的 16S rRNA 基因設(shè)計一系列特異性探針，可以區(qū)分不同門、綱、目、科、屬的細菌在環(huán)境樣品中的存在情況，構(gòu)建微生物群落的組成圖譜。
- 群落動態(tài)變化監(jiān)測
在環(huán)境受到污染、氣候變化或生態(tài)修復(fù)等過程中，環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生相應(yīng)的變化。通過定期采集環(huán)境樣品，采用核酸雜交技術(shù)對特定微生物類群或功能基因進行檢測，可以實時監(jiān)測微生物群落的動態(tài)變化過程。例如，在土壤污染修復(fù)過程中，利用針對降解特定污染物的微生物功能基因探針進行雜交分析，觀察隨著修復(fù)時間的推移，具有該功能基因的微生物種群豐度的變化，評估修復(fù)措施對微生物群落的影響以及修復(fù)效果。
（二）特定微生物種群檢測
- 致病微生物檢測
在環(huán)境微生物研究中，對環(huán)境中的致病微生物進行檢測具有重要意義，如飲用水源中的病原體檢測。核酸雜交技術(shù)可設(shè)計針對致病微生物特異性基因序列的探針，快速、靈敏地檢測環(huán)境樣品中是否存在致病微生物及其數(shù)量。例如，針對大腸桿菌 O157:H7 的特定毒力基因設(shè)計核酸探針，通過雜交反應(yīng)可以在復(fù)雜的水樣中準確檢測出該致病菌株的存在，為保障飲用水安全提供技術(shù)支持。
- 稀有微生物種群鑒定
環(huán)境中存在許多豐度極低但具有特殊生態(tài)功能或潛在應(yīng)用價值的稀有微生物種群。核酸雜交技術(shù)的高靈敏度使其能夠在大量背景微生物存在的情況下檢測到這些稀有微生物。例如，在深海熱泉環(huán)境中，利用針對某些極端嗜熱微生物獨特基因序列的探針進行原位雜交，可以發(fā)現(xiàn)和鑒定那些難以通過傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離得到的稀有微生物，有助于深入了解極端環(huán)境微生物資源。
（三）微生物功能基因研究
- 功能基因的篩選與鑒定
環(huán)境微生物蘊含著豐富的功能基因資源，這些基因參與了各種生物地球化學(xué)循環(huán)過程，如氮循環(huán)、碳循環(huán)等。核酸雜交技術(shù)可用于從環(huán)境樣品中篩選和鑒定具有特定功能的基因。通過設(shè)計與目標功能基因序列互補的探針，與環(huán)境樣品中的總 DNA 或 cDNA 文庫進行雜交，可以快速定位和鑒定感興趣的功能基因。例如，針對參與氮固定過程的固氮酶基因設(shè)計探針，在土壤微生物基因組文庫中進行雜交篩選，能夠發(fā)現(xiàn)新的固氮微生物及其固氮基因序列。
- 功能基因表達調(diào)控研究
除了檢測功能基因的存在，核酸雜交技術(shù)還可用于研究微生物功能基因的表達調(diào)控。Northern 雜交可以直接檢測環(huán)境微生物在不同環(huán)境條件下特定功能基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，從而揭示微生物基因表達與環(huán)境因素之間的關(guān)系。例如，研究在不同溫度、營養(yǎng)物質(zhì)濃度等條件下，微生物參與有機物降解基因的表達調(diào)控機制，有助于深入理解微生物對環(huán)境變化的適應(yīng)策略以及優(yōu)化生物修復(fù)過程中的微生物活性調(diào)控。
（四）微生物與環(huán)境相互作用研究
- 微生物與植物根系相互作用
在植物根系周圍存在著復(fù)雜的根際微生物群落，這些微生物與植物之間存在著密切的相互作用，如促進植物生長、提高植物抗逆性等。核酸雜交技術(shù)可用于研究根際微生物群落中與植物相互作用相關(guān)的微生物種群及其功能基因。例如，設(shè)計針對能夠產(chǎn)生植物生長激素或具有生物防治功能的微生物基因探針，通過對根際土壤樣品進行雜交分析，了解這些有益微生物在根際的分布和豐度變化，以及它們與植物根系分泌物、土壤養(yǎng)分等環(huán)境因素之間的相互關(guān)系，為開發(fā)高效的微生物肥料和生物防治劑提供理論依據(jù)。
- 微生物與污染物相互作用
在污染環(huán)境中，微生物與污染物之間的相互作用決定了污染物的降解轉(zhuǎn)化過程。核酸雜交技術(shù)可用于研究參與污染物降解的微生物種群及其功能基因在污染環(huán)境中的表達和調(diào)控。例如，在石油污染土壤中，針對石油烴降解基因設(shè)計探針，分析在不同污染程度、不同修復(fù)階段下，具有降解功能的微生物種群豐度和基因表達水平的變化，揭示微生物對石油污染物的降解機制以及環(huán)境因素對降解過程的影響，為優(yōu)化石油污染土壤修復(fù)技術(shù)提供數(shù)據(jù)支持。
四、基于核酸雜交技術(shù)的環(huán)境微生物研究實驗流程示例
（一）實驗材料準備
- 環(huán)境樣品采集
根據(jù)研究目的，選擇合適的環(huán)境樣品采集地點和方法。例如，采集土壤樣品時，可使用無菌采樣器在不同深度、不同植被覆蓋區(qū)域采集多個樣本，將采集的土壤樣品混合均勻后裝入無菌袋中，迅速帶回實驗室進行處理。對于水樣采集，可使用經(jīng)過滅菌處理的采樣瓶在水體不同深度、不同位置采集水樣，采樣后盡快進行過濾或其他預(yù)處理以濃縮微生物。
- 試劑與儀器
準備用于核酸提取、純化、雜交反應(yīng)及檢測的各種試劑，如 DNA 提取試劑盒、RNA 提取試劑盒、限制性內(nèi)切酶、DNA 聚合酶、核酸探針標記試劑盒、雜交緩沖液、洗滌緩沖液等。同時，準備實驗所需的儀器設(shè)備，包括離心機、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、核酸雜交箱、熒光顯微鏡（用于熒光原位雜交檢測）、放射性檢測儀（用于放射性同位素標記探針檢測）等。
（二）核酸提取與純化
- DNA 提取
根據(jù)環(huán)境樣品的性質(zhì)選擇合適的 DNA 提取方法。對于土壤樣品，可采用酚 - 氯仿抽提法或商業(yè) DNA 提取試劑盒。以酚 - 氯仿抽提法為例，首先將土壤樣品與提取緩沖液混合，加入蛋白酶 K 進行裂解，然后依次加入酚、氯仿進行抽提，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，最后通過乙醇沉淀法回收 DNA。提取得到的 DNA 用適量的 TE 緩沖液溶解，并通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度。
- RNA 提取
對于需要進行 Northern 雜交檢測 RNA 的實驗，采用 RNA 提取試劑盒進行 RNA 提取。按照試劑盒說明書操作，在提取過程中要注意防止 RNA 酶的污染，可使用 DEPC 處理水和 RNase - free 的耗材。提取后的 RNA 同樣通過瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其完整性和濃度。
（三）核酸雜交實驗操作
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Southern 雜交
（1）DNA 酶切與電泳
將提取的環(huán)境樣品 DNA 用合適的限制性內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，酶切體系根據(jù)酶的說明書進行配制，在適宜溫度下孵育一定時間。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件根據(jù) DNA 片段大小進行設(shè)置，一般采用低電壓長時間電泳，以確保 DNA 片段充分分離。
（2）轉(zhuǎn)膜
電泳結(jié)束后，采用堿變性法將凝膠中的 DNA 片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜上。將尼龍膜放在凝膠上方，依次鋪上濾紙、吸水紙等，通過毛細作用將 DNA 轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移過程中要注意避免氣泡產(chǎn)生，確保轉(zhuǎn)移效率。轉(zhuǎn)移完成后，將膜在 80°C 下烘烤固定一定時間。
（3）探針標記與雜交
采用放射性同位素（如 32P）或非放射性標記物（如地高辛）對核酸探針進行標記。以地高辛標記為例，按照標記試劑盒說明書進行操作。標記好的探針與尼龍膜上的 DNA 片段在雜交緩沖液中進行雜交反應(yīng)，雜交溫度和時間根據(jù)探針和目標序列的特性進行優(yōu)化，一般在 42°C - 65°C 下雜交過夜。
（4）洗膜與檢測
雜交完成后，依次用不同濃度的洗滌緩沖液在適宜溫度下洗膜，去除未雜交的探針。對于地高辛標記的探針，采用抗地高辛抗體與雜交體結(jié)合，然后通過化學(xué)顯色反應(yīng)進行檢測，在膜上出現(xiàn)有色條帶的位置即為目標 DNA 序列所在位置，通過條帶的強度可大致判斷目標序列的豐度。對于放射性同位素標記的探針，則通過放射自顯影檢測雜交信號。
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Northern 雜交
（1）RNA 變性電泳
將提取的 RNA 樣品與甲醛變性劑混合，在 65°C 下變性一定時間后迅速置于冰上冷卻。然后將變性后的 RNA 進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳過程中使用甲醛變性瓊脂糖凝膠和 MOPS 緩沖液，電泳條件根據(jù) RNA 大小進行設(shè)置。
（2）轉(zhuǎn)膜與固定
電泳結(jié)束后，將 RNA 轉(zhuǎn)移至尼龍膜上，轉(zhuǎn)膜方法與 Southern 雜交類似，但轉(zhuǎn)膜過程中要注意保持 RNA 的變性狀態(tài)。轉(zhuǎn)膜完成后，將膜在紫外交聯(lián)儀上進行交聯(lián)固定或在 80°C 下烘烤固定。
（3）探針雜交與檢測
與 Southern 雜交中的探針雜交和檢測步驟基本相同，但由于 RNA 的穩(wěn)定性較差，雜交和洗膜條件要更加溫和，以避免 RNA 的降解。
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原位雜交
（1）樣品固定與處理
將采集的環(huán)境樣品（如組織切片或細胞涂片）用固定劑（如 4% 多聚甲醛）固定一定時間，然后進行通透處理，可使用蛋白酶 K 或 Triton X - 100 等試劑，使細胞通透性增加，便于探針進入細胞內(nèi)。
（2）探針雜交
將標記有熒光物質(zhì)（如 FITC、Cy3 等）的核酸探針與處理后的樣品在雜交緩沖液中進行雜交反應(yīng)，雜交溫度和時間根據(jù)探針和樣品的特性進行優(yōu)化，一般在 37°C - 50°C 下雜交 1 - 3 小時。
（3）洗膜與觀察
雜交完成后，用洗滌緩沖液洗去未結(jié)合的探針，然后在熒光顯微鏡下觀察樣品，細胞內(nèi)出現(xiàn)熒光信號的位置即為目標核酸所在位置，通過熒光強度可大致判斷目標核酸的豐度和分布情況。
五、核酸雜交技術(shù)在環(huán)境微生物研究中的未來發(fā)展趨勢
隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，核酸雜交技術(shù)在環(huán)境微生物研究中也將不斷創(chuàng)新和完善。一方面，新型核酸探針的設(shè)計和開發(fā)將進一步提高核酸雜交技術(shù)的特異性和靈敏性。例如，利用納米材料修飾的核酸探針、分子信標探針等新型探針技術(shù)，能夠更精準地檢測環(huán)境樣品中的目標微生物或基因序列，并且能夠?qū)崿F(xiàn)對微生物生理狀態(tài)的實時監(jiān)測。另一方面，核酸雜交技術(shù)將與其他現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，如高通量測序技術(shù)、微流控技術(shù)等，實現(xiàn)對環(huán)境微生物群落的更全面、更深入的分析。高通量測序技術(shù)能夠提供大量的微生物核酸序列信息，而核酸雜交技術(shù)可用于對測序結(jié)果中的特定序列進行驗證和定量分析，兩者結(jié)合能夠更準確地解析環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。微流控技術(shù)則能夠?qū)⒑怂犭s交實驗微型化、自動化，提高實驗效率和檢測通量，降低實驗成本，有望在環(huán)境微生物現(xiàn)場快速檢測和監(jiān)測方面得到廣泛應(yīng)用。此外，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，核酸雜交數(shù)據(jù)的分析和解讀將更加智能化和高效化，能夠從大量的雜交數(shù)據(jù)中挖掘出更多有價值的環(huán)境微生物生態(tài)信息，為環(huán)境微生物研究和生態(tài)環(huán)境保護提供更有力的支持。
