電轉(zhuǎn)化外源質(zhì)粒至干酪乳桿菌的研究
一、引言
二、材料與方法
（一）菌株與質(zhì)粒
（一）電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 （二）脈沖時(shí)間對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 （三）質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 （四）細(xì)胞預(yù)處理對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響
（一）菌株與質(zhì)粒
- 菌株：本研究選用干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）[具體菌株編號(hào)] 作為宿主菌，該菌株購(gòu)自 [菌種保藏機(jī)構(gòu)名稱]。
- 質(zhì)粒：采用具有特定篩選標(biāo)記（如抗生素抗性基因）的外源質(zhì)粒 [質(zhì)粒名稱]，其構(gòu)建和來源見 [相關(guān)文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)記錄]。
- 培養(yǎng)基
- MRS 培養(yǎng)基（de Man, Rogosa and Sharpe Medium）：用于干酪乳桿菌的培養(yǎng)與活化，其組成成分（g/L）為：蛋白胨 10.0，牛肉膏 10.0，酵母膏 5.0，葡萄糖 20.0，吐溫 - 80 1.0，磷酸氫二鉀 2.0，乙酸鈉 5.0，檸檬酸三銨 2.0，硫酸鎂 0.58，硫酸錳 0.25，瓊脂 15.0（固體培養(yǎng)基添加），pH 6.2 - 6.4。
- SOC 培養(yǎng)基：用于電轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，其組成成分（g/L）為：蛋白胨 20.0，酵母膏 5.0，氯化鈉 0.5，氯化鉀 0.186，硫酸鎂 0.98，葡萄糖 3.6，pH 7.0。
- 試劑
- 電擊緩沖液：采用 10% 甘油 + 0.5 M 蔗糖溶液，用超純水配制，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾除菌后備用。
- 抗生素：根據(jù)質(zhì)粒所攜帶的篩選標(biāo)記，選用相應(yīng)的抗生素（如氯霉素、紅霉素等），配制成適當(dāng)濃度的儲(chǔ)存液，使用時(shí)按所需終濃度添加至培養(yǎng)基中。
- 電穿孔儀（[品牌型號(hào)]）：用于施加電擊脈沖，實(shí)現(xiàn)外源質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)化。
- 低溫離心機(jī)（[品牌型號(hào)]）：能夠在低溫條件下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行離心操作，以收集菌體和去除上清液等。
- 超凈工作臺(tái)：提供無菌操作環(huán)境，防止雜菌污染實(shí)驗(yàn)樣品。
- 恒溫培養(yǎng)箱：用于培養(yǎng)干酪乳桿菌，控制培養(yǎng)溫度在 37°C。
- 將 - 80°C 保存的干酪乳桿菌甘油菌劃線接種于 MRS 固體培養(yǎng)基平板上，37°C 培養(yǎng) 24 - 48 h，至長(zhǎng)出單菌落。
- 挑取單菌落接種至 5 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，37°C、180 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜，獲得種子液。
- 以 1%（v/v）的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至 50 mL MRS 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期（OD₆₀₀約為 0.4 - 0.6）。
- 收集菌體：將培養(yǎng)好的菌液置于冰上預(yù)冷 10 min，然后在 4°C、5000 r/min 條件下離心 10 min，棄去上清液。
- 細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷的電擊緩沖液重懸菌體，再次離心（4°C、5000 r/min、10 min），重復(fù)洗滌 2 - 3 次，以去除培養(yǎng)基殘留成分對(duì)電轉(zhuǎn)化的影響。
- 細(xì)胞預(yù)處理：最后一次洗滌后，用適量的電擊緩沖液重懸菌體，調(diào)整細(xì)胞濃度至約 1×10¹⁰ - 1×10¹¹ CFU/mL。對(duì)于部分實(shí)驗(yàn)組，在重懸時(shí)添加一定濃度的外源物質(zhì)（如甘氨酸、氯化鎂等），在冰上孵育 30 - 60 min，以改變細(xì)胞壁通透性，提高電轉(zhuǎn)化效率。
- 采用堿裂解法提取外源質(zhì)粒 [質(zhì)粒名稱]，具體操作步驟參照 [分子克隆實(shí)驗(yàn)指南等相關(guān)文獻(xiàn)]。提取后的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和完整性，并使用核酸定量?jī)x測(cè)定質(zhì)粒濃度。
- 將提取的質(zhì)粒稀釋至不同濃度梯度（如 1 ng/μL、10 ng/μL、100 ng/μL 等），備用。
- 取 100 μL 預(yù)處理后的菌體與不同體積（如 1 μL、5 μL、10 μL 等）和濃度的外源質(zhì)�；旌�，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電穿孔杯中（電極間距 0.2 cm）。
- 將電穿孔杯置于電穿孔儀中，設(shè)置不同的電轉(zhuǎn)化參數(shù)，包括電場(chǎng)強(qiáng)度（如 1.0 kV/cm、1.5 kV/cm、2.0 kV/cm 等）、脈沖時(shí)間（如 3 ms、5 ms、10 ms 等）和脈沖次數(shù)（一般為 1 - 3 次）。
- 施加電擊脈沖后，立即向電穿孔杯中加入 900 μL SOC 培養(yǎng)基，輕輕混勻，然后將菌液轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 無菌離心管中。
- 37°C、180 r/min 振蕩培養(yǎng) 2 - 3 h，使細(xì)胞復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒所攜帶的抗性基因。
- 復(fù)蘇培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋（如 10⁻¹ - 10⁻⁶ 倍），取 100 μL 稀釋后的菌液涂布于含有相應(yīng)抗生素的 MRS 固體培養(yǎng)基平板上，37°C 培養(yǎng) 48 - 72 h，直至長(zhǎng)出可見菌落。
- 統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，并根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率，公式為：轉(zhuǎn)化效率（CFU/μg DNA）=(轉(zhuǎn)化子菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù))/(質(zhì)粒 DNA 加入量（μg）)。
（一）電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 （二）脈沖時(shí)間對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 （三）質(zhì)粒濃度對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響 （四）細(xì)胞預(yù)處理對(duì)電轉(zhuǎn)化效率的影響
- 甘氨酸預(yù)處理：在重懸菌體時(shí)添加不同濃度（0.5%、1.0%、2.0%）的甘氨酸，在冰上孵育 30 min 后進(jìn)行電轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，甘氨酸預(yù)處理能夠顯著提高電轉(zhuǎn)化效率，其中 1.0% 甘氨酸處理組的轉(zhuǎn)化效率最高，相比未處理組提高了約 [Z] 倍。甘氨酸能夠削弱細(xì)胞壁中的肽聚糖交聯(lián)，增加細(xì)胞壁的通透性，從而有利于外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞。但甘氨酸濃度過高時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁過度破壞，影響細(xì)胞的完整性和存活率，進(jìn)而降低轉(zhuǎn)化效率。
- 氯化鎂預(yù)處理：添加不同濃度（5 mM、10 mM、20 mM）的氯化鎂進(jìn)行細(xì)胞預(yù)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，10 mM 氯化鎂處理組的電轉(zhuǎn)化效率有所提高，比未處理組提高了約 [A]%。氯化鎂可能通過影響細(xì)胞膜的穩(wěn)定性和表面電荷分布，促進(jìn)外源質(zhì)粒與細(xì)胞膜的相互作用，從而提高轉(zhuǎn)化效率。然而，過高濃度的氯化鎂可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)滲透壓的改變，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。
標(biāo)簽：
分子雜交儀、核酸雜交儀、基因雜交儀
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