NOX2誘導生成的ROS和PITX2在肥胖介導的房顫中發(fā)揮的作用
心房顫動（AF）是最常見的持續(xù)性心律失常。越來越多的數(shù)據(jù)證明肥胖（身體質(zhì)量指數(shù)[BMI]≥30 kg/m2）是造成房顫的關(guān)鍵因素之一。人類和動物研究表明，肥胖誘導的心房重構(gòu)會產(chǎn)生一種促纖維化底物進而誘導房顫發(fā)生，在喂食高脂肪飲食（HFD）的飲食誘導肥胖（DIO）小鼠中，心房的結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)會增加 AF 患病風險。然而，肥胖介導 AF 的分子機制仍然知之甚少。
氧化應激和活性氧（ROS）的產(chǎn)生在介導肥胖誘導的心房重構(gòu)和房顫的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。產(chǎn)生 ROS 的主要來源是 NADPH 氧化酶（NOX）、線粒體、黃嘌呤氧化酶、細胞色素 c 氧化酶和一氧化氮合酶。研究顯示，識別和靶向參與 ROS 產(chǎn)生的特定途徑，如 NOX2，可能不僅可抑制房顫，還可阻止其在肥胖介導的房顫中的進展。
此外，與房顫患者 4q25 染色體位點相關(guān)的配對樣同源結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子2 （PITX2）表達改變導致人和小鼠心房電特性異常，突出了其在房顫病理生理中的重要意義。研究 PITX2 誘導的電重構(gòu)對心律失常的影響是理解和治療房顫的關(guān)鍵一步。然而，PITX2 在肥胖介導的房顫和 NOX2 升高中的具體作用尚不清楚。
基于此，美國伊利諾伊大學芝加哥分校 Dawood Darbar 團隊在The Journal of Clinical Investigation雜志(最新IF: 13.3)上發(fā)表“Modulation of NOX2 causes obesity-mediated atrial fibrillation”相關(guān)文章。
假設(shè) NOX2 在肥胖介導的房顫中通過調(diào)節(jié) PITX2 驅(qū)動氧化應激產(chǎn)生 ROS，導致心房通道和結(jié)構(gòu)改變。為了驗證這一點，文章中使用了 NOX2 敲除（KO）小鼠模型和棕櫚酸（PA）處理的 hiPSC-aCMs，并用 Apocynin（NOX 阻滯劑）和 GSK-2795039 （NOX2 抑制劑）處理�？傊�，肥胖小鼠和 PA 處理的 hiPSC-aCMs 中 NOX2 的遺傳和藥理學抑制消除了離子通道和結(jié)構(gòu)重塑，并通過 PITX2 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)預防肥胖介導的房顫。
研究結(jié)果：
1. 在肥胖個體的心房組織中，NOX2 表達增加
已有實驗證明 DIO 小鼠由肥胖介導的 AF 中 NOX2 蛋白表達增加，為了進一步檢測肥胖個體心房組織中 NOX2（NADPH 氧化酶 2）的表達水平，本實驗采用實時定量 PCR（qPCR）技術(shù)，觀察到在 BMI 大于 30 kg/m2 的個體中，人心房 NOX2 的 mRNA 表達增加。與消瘦個體相比，肥胖個體的心房 NOX2 的表達增加了 2 倍以上。然后，我們評估了心臟離子通道和結(jié)構(gòu)基因的表達。與消瘦個體相比，肥胖個體的 KCNA5 mRNA 表達顯著增加。在超重和肥胖的個體中，編碼連接蛋白 40 的 GJA5 的 mRNA 表達量也有所下降。相比之下，與消瘦個體相比，編碼 INa 的 SCN5A 沒有顯著變化；編碼 ICa,L 的 CACNA1C 在肥胖個體中顯著增加。
為了明確 NOX2 與肥胖介導的人類 AF 中心房離子通道重構(gòu)之間的關(guān)聯(lián)，本研究評估了對照組、DIO 組、Nox2-KO（Nox2 敲除）組和DIO Nox2-KO 組四組小鼠的體重水平：與對照組和 Nox2-KO 小鼠相比，DIO、DIO-Apocynin 和 DIO Nox2-KO 小鼠的體重增加。與對照組和Nox2-KO 小鼠相比，DIO、DIO-Apocynin 和 DIO Nox2-KO 小鼠的平均體重顯著增加。經(jīng)食管心房起搏后，觀察到與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 和 DIO-Apocynin 小鼠的 AF 負擔顯著降低。DIO Nox2-KO 小鼠和 DIO-Apocynin 小鼠的 AF 持續(xù)時間顯著低于 DIO 小鼠。此外，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠 AF 發(fā)生率降低，而 DIO-Apocynin 小鼠的變化無統(tǒng)計學意義。綜上所述，NOX2 表達的遺傳和藥理抑制都可以抑制 DIO 小鼠起搏誘導的 AF。
圖1. NOX2 的遺傳和藥理抑制作用減少了肥胖介導的 AF
3. 抑制 Nox2 的表達使心房 APD 正�；瘡亩孓D(zhuǎn)肥胖介導的房顫
為了評估 Nox2 缺失對心房心肌細胞的電生理學影響，分別檢測四組小鼠心房心肌細胞的電生理變化。結(jié)果表明，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠的心房 AP 時程延長、最大 AP 振幅（APAmax）和上升速度（dV/dTmax）均顯著升高。此外，DIO Nox2-KO 小鼠的心房 AP 與對照組和 Nox2-KO 小鼠非常相似，3 組間的 APD20、APD50、APD90、APAmax、dV/dTmax 均無變化。
4. DIO Nox2-KO 小鼠通過調(diào)節(jié) INa 和 IKs 來恢復 APD
為了確定抑制 NOX2 蛋白表達對心房 INa 的影響，對 4 組小鼠進行了全細胞膜片鉗檢測，結(jié)果證明，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠的峰值 INa 密度顯著增加，在所有測試電位下 INa 密度均恢復，與對照小鼠和 Nox2-KO 小鼠相似。此外，DIO Nox2-KO 和 DIO-Apocynin 小鼠中 Nav 1.5 蛋白表達也顯著增加。已知 Nox2 的增加導致 PKC 亞型蛋白的表達增加從而下調(diào) Nav 1.5 的表達最終抑制 INa。由此，對對照組、DIO、Nox2-KO 和 DIO Nox2-KO 小鼠進行免疫印跡檢測，結(jié)果顯示，敲除 Nox2 逆轉(zhuǎn)了肥胖誘導的 PKC-α 和 PKC-δ 亞型蛋白表達的增加。
與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠在 30 mV 和 50 mV 時的 IKs 密度顯著降低。DIO Nox2-KO 小鼠 Kv 7.1 和 MinK 蛋白表達降低，但 Kv 1.5 主要鉀通道保持不變。DIO Nox2-KO 小鼠顯示編碼 IKs 的 Kcnq1、Kcne1 和編碼 IKur 的 Kcna5 的 mRNA 表達減少。最后，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠中 Kcnj3（乙酰膽堿活化鉀通道（IKACh）的一部分）的表達顯著降低。之前的研究表明，心房利鈉肽（ANP）活性的增加可以調(diào)節(jié)含有 NPPA 突變的 hiPSC-aCMs 中的 IKs。與對照組相比，DIO 小鼠 ANP mRNA 和蛋白表達明顯增加，而在 DIO Nox2-KO 小鼠中表達被抑制。
圖2. DIO Nox2-KO 小鼠顯示出心房動作電位的增加和肥胖誘導的離子通道重構(gòu)的消除
5. 抑制 NOX2 的表達改善了 DIO 小鼠心房心肌細胞和 PA 處理的 hiPSC-aCMs 的收縮性
ICa,L 密度的降低是 DIO 小鼠心房電重構(gòu)的一個標志。ICa,L 的減少抑制了肌漿網(wǎng)（SR）的鈣釋放和整體心房的收縮力。為了進一步評估這一變化，應用膜片鉗技術(shù)分別對四組小鼠心房心肌細胞進行 ICa,L 的檢測，并使用熒光鈣染料 Fura-2 進行鈣瞬變檢測。實驗結(jié)果表明，在 DIO Nox2-KO 小鼠中，ICa,L 減少得到了顯著緩解并且 Ca2+ 濃度高于 DIO 小鼠心房細胞，說明 DIO Nox2- KO 小鼠肌漿網(wǎng)鈣釋放量的增加。與對照組和 DIO Nox2-KO 組小鼠心房細胞相比，DIO 組小鼠心房細胞肌節(jié)的縮短得到顯著抑制。
圖3. NOX2 抑制可改善 DIO 小鼠的心房收縮力
6. 使用 NOX2 小分子抑制劑能夠抑制 PA 處理的 hiPSC-aCMs 中 NOX2 的表達，逆轉(zhuǎn)了肥胖誘導的離子通道重構(gòu)
流式細胞計數(shù)法結(jié)果顯示，與 DMSO 處理的細胞相比，視黃酸處理的細胞中表達 Kv 1.5 的細胞百分比顯著增加，而表達心室標記物 MLC2v 的細胞百分比顯著下降。為了探究 NOX2 在介導脂肪酸（FA）誘導的心房重構(gòu)中的作用，本實驗選用 PA 和 NOX2 小分子抑制劑 GSK-2795039（20μM，PA-GSK-hiPSC-aCMs）和油酸（OA）處理 5 天。熒光標測技術(shù)結(jié)果表明與 PA 處理的 hiPSC-aCMs 相比，PA-GSK-hiPSC-aCMs 的 APD10、APD50、APD90 均有所恢復。與 DIO 小鼠一樣，經(jīng) PA 處理的 hiPSC-aCMs 也顯示出 IKs 和總 IK 的增加，而在 PA-GSK-hiPSC-aCMs 中則被逆轉(zhuǎn)。全細胞膜片鉗檢測結(jié)果顯示，慢性 PA 治療縮短了 APD 在20%、50% 和 90% 的復極化，而 OA 治療顯著延長了 APD50，增加了除極速度。與牛血清白蛋白（BSA）-hiPSC-aCMs 相比，PA-hiPSC-aCMs 的 AP 最大上升速度和最大（APAmax）振幅顯著降低。此外，與對照組 hiPSC-aCMs 相比，PA-hiPSC-aCMs 也顯示出 INa 和 ICa,L 密度的降低，而在 PA-GSK-hiPSC-aCMs 中則發(fā)生了逆轉(zhuǎn)。因此，這提示在 DIO Nox2-KO 小鼠和 PA-GSK-hiPSC-aCMs 中，NOX2 的基因缺失和藥理抑制消除了肥胖介導的心房 APD 縮短，并緩解了肥胖誘導的房顫。超聲心動圖分析顯示，與對照組小鼠相比，DIO 小鼠的 LA 和 RA 均增大。其他超聲心動圖參數(shù)，如左心室射血分數(shù)、縮短分數(shù)、主動和被動心室充盈之間的脈搏波比 （A'/E'）、心輸出量和左心室后壁直徑在 4 組小鼠中保持不變。
圖4. 使用 NOX2 小分子抑制劑 GSK-2795039 對 PA 處理的 hiPSC-aCMs 進行抑制 NOX2 時，可以逆轉(zhuǎn)肥胖誘導的離子通道重構(gòu)
7. 抑制 NOX2 表達可預防肥胖介導的心房纖維化，增加心房 CV
為了研究傳導的變化，采用 Langendorff 離體心臟灌流系統(tǒng)分別灌流對照組、DIO 組、Nox2-KO（Nox2 敲除）組和 DIO Nox2-KO 組小鼠離體心臟，進行心房和左心室的心外膜多通道電生理標測。實驗結(jié)果表明，與對照組相比，DIO、Nox2-KO 和 DIO Nox2-KO 小鼠的心房和左心室的 CV 均減少。然而，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠的 LA、RA 和左心室 CV 均得到了改善。等時線圖顯示，與 DIO 小鼠相比，DIO Nox2-KO 小鼠的兩個心房的 CV 均顯著升高。然后，通過對四組小鼠心房組織進行天狼星紅染色和 Masson 三色染色，確定抑制 NOX2 表達對肥胖誘導的心房纖維化的作用。結(jié)果表明，與對照組和 DIO Nox2-KO 小鼠相比，DIO 小鼠的 LA 和 RA 切片出現(xiàn)明顯的纖維化。然而，4 組小鼠的心室切片纖維化程度沒有差異。
圖5. NOX2 抑制可預防 DIO 小鼠的心房纖維化并增加心房 CV
8. 抑制 Nox2 表達降低了 DIO 小鼠和 PA-hiPSC-aCMs 中 ROS 的產(chǎn)生
使用 H2DCFDA 染色（一種成熟的可視化和定量胞質(zhì) ROS 的技術(shù)），評估了對照組小鼠、DIO 小鼠、Nox2-KO 小鼠、DIO Nox2-KO 心房心肌細胞和 BSA-、PA-、PA-GSK-hiPSC-aCMs 的 ROS 水平（在基線和染色 12 分鐘后進行測量）。與對照組、Nox2-KO 和 DIO Nox2-KO 小鼠心房肌細胞不同，DIO 小鼠的 ROS 水平顯著升高。這種增長持續(xù)了 12 分鐘，這是 DIO 組獨有的趨勢。同樣，與 BSA- 和 PA-GSK-hiPSC-aCMs 相比，PA 處理的 hiPSC-aCMs 從一開始就出現(xiàn)升高現(xiàn)象，并且在 12 分鐘內(nèi)持續(xù)顯著升高。
圖6. 使用 NOX2 小分子抑制劑 GSK-2795039 對 PA 處理的 hiPSC-aCMs 的 NOX2 抑制逆轉(zhuǎn)了肥胖誘導的離子通道重構(gòu)
研究結(jié)論：
本研究強調(diào)了 NOX2 誘導生成的 ROS 和 PITX2 在肥胖介導的房顫中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。機制研究表明，在肥胖小鼠、PA 處理的 hiPSC-aCMs 中以及敲除 NOX2 后，使用 NOX 阻滯劑和 NOX2 特異性抑制劑靶向心房氧化損傷和 ROS 產(chǎn)生，不僅可以預防和治療 AF，還可以延緩肥胖個體中 AF 的進展。本課題研究結(jié)果對房顫肥胖患者的靶向治療具有重要意義，靶向抑制 NOX2 可能是一種新的治療肥胖患者的方法，并為肥胖介導的房顫患者提供新的輔助治療方案。
- 關(guān)于人類多選擇知覺選擇中的神經(jīng)動力學決策變量的研究
- 通過人類海馬神經(jīng)元的相位-振幅耦合來控制工作記憶
- 使用電生理神經(jīng)信號采集系統(tǒng)研究獼猴自發(fā)運動過程中的神經(jīng)認知信號
- 皮質(zhì)紋狀體谷氨酸介導的電針在帕金森病大鼠模型中的動態(tài)治療效果
- NOX2誘導生成的ROS和PITX2在肥胖介導的房顫中發(fā)揮的作用
- 優(yōu)化Nav1.7靶向鎮(zhèn)痛藥助力揭示蜘蛛毒液衍生肽毒素脫靶效應和改進策略
- 調(diào)節(jié)人類前額葉控制揭示了競爭成功和集體浪費的不同途徑
- 衰老的CD8+T細胞參與心律失常鈣失調(diào)的作用機制及與房顫發(fā)病率的關(guān)系
