一、引言
 
染色體異常是導(dǎo)致胎兒先天畸形、智力低下、發(fā)育遲緩等多種不良妊娠結(jié)局的重要原因之一。產(chǎn)前診斷對于發(fā)現(xiàn)染色體異常胎兒，為家庭和臨床提供決策依據(jù)具有至關(guān)重要的作用。傳統(tǒng)的染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法存在操作復(fù)雜、耗時長（一般需要數(shù)天至數(shù)周）等缺點(diǎn)，尤其是對于急需診斷結(jié)果的孕婦（如孕周較大等情況）并不十分理想。
 
熒光原位雜交（FISH）技術(shù)作為一種分子細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，具有快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，能夠在較短時間內(nèi)對羊水細(xì)胞中的特定染色體異常進(jìn)行檢測。它可以檢測染色體的數(shù)目異常，如 21 - 三體、18 - 三體、13 - 三體等，以及部分染色體結(jié)構(gòu)異常。近年來，F(xiàn)ISH 技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用，為染色體異常的早期診斷提供了一種有效的手段，大大提高了產(chǎn)前診斷的效率和質(zhì)量。
 
二、熒光原位雜交技術(shù)原理
 
FISH 技術(shù)是基于核酸分子雜交原理。它利用已知序列的熒光標(biāo)記核酸探針與細(xì)胞內(nèi)的染色體 DNA 進(jìn)行特異性雜交。這些探針可以特異性地識別染色體上特定的基因序列或區(qū)域。當(dāng)探針與目標(biāo) DNA 序列互補(bǔ)結(jié)合后，在熒光顯微鏡下可以觀察到熒光信號。通過對熒光信號的數(shù)量、位置和分布等特征的分析，可以判斷染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)是否正常。
 
例如，對于檢測 21 - 三體綜合征，可以使用針對 21 號染色體特異性的探針。正常細(xì)胞中，在熒光顯微鏡下會觀察到兩個特定的熒光信號（對應(yīng)兩條 21 號染色體），而如果是 21 - 三體細(xì)胞，則會觀察到三個熒光信號。
 
三、實(shí)驗(yàn)材料與方法
 
（一）羊水樣本采集
 
羊水樣本一般在孕中期（16 - 22 周）通過羊膜腔穿刺術(shù)獲取。在超聲引導(dǎo)下，將穿刺針經(jīng)腹壁、子宮壁刺入羊膜腔，抽取一定量（一般 10 - 20ml）的羊水。采集過程中要嚴(yán)格遵循無菌操作原則，以防止感染。采集后的羊水應(yīng)立即送檢，避免長時間放置導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。
 
（二）羊水細(xì)胞處理
 
1. 離心分離
將采集到的羊水樣本在低溫離心機(jī)中以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速（如 1000 - 1500rpm）離心 10 - 15 分鐘，使羊水細(xì)胞沉淀在離心管底部。
 

• 細(xì)胞培養(yǎng)（可選）
  對于需要進(jìn)一步培養(yǎng)以獲得更多細(xì)胞的情況，可以將沉淀的羊水細(xì)胞接種到特定的培養(yǎng)基中，在合適的培養(yǎng)條件（37℃、5% CO₂）下培養(yǎng)數(shù)天。培養(yǎng)后的細(xì)胞可以獲得更好的細(xì)胞形態(tài)和更多的染色體信息，但這會增加診斷時間。在一些緊急情況下，可以直接使用未經(jīng)培養(yǎng)的羊水細(xì)胞進(jìn)行 FISH 檢測。

 

• 細(xì)胞固定
  無論是培養(yǎng)后的細(xì)胞還是直接離心獲得的細(xì)胞，都需要進(jìn)行固定處理。常用的固定劑為甲醇 - 冰醋酸（3:1）混合液。將細(xì)胞懸浮在固定劑中，反復(fù)固定幾次，以保證細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，染色體形態(tài)清晰，便于后續(xù)雜交操作。

 
（三）探針選擇與標(biāo)記
 
1. 探針類型
根據(jù)需要檢測的染色體異常類型選擇合適的探針。常見的探針包括染色體著絲粒探針、染色體特異性位點(diǎn)探針和全染色體涂抹探針等。例如，對于常見的三體綜合征診斷，常使用著絲粒探針。對于檢測染色體易位等結(jié)構(gòu)異常，可以使用特異性位點(diǎn)探針或全染色體涂抹探針。
 

• 探針標(biāo)記
  探針標(biāo)記有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種方式。直接標(biāo)記是將熒光素（如 FITC、Cy3、Cy5 等）直接連接到探針上。間接標(biāo)記則是先將生物素或地高辛等標(biāo)記物連接到探針上，然后在雜交后通過與熒光標(biāo)記的親和物質(zhì)（如熒光標(biāo)記的抗生物素抗體或抗地高辛抗體）反應(yīng)來顯示熒光信號。直接標(biāo)記操作相對簡單，而間接標(biāo)記可以通過信號放大提高檢測靈敏度。

 
（四）雜交過程
 
1. 預(yù)處理
將固定好的羊水細(xì)胞涂片或滴片在適當(dāng)?shù)念A(yù)處理液（如 70% 甲酰胺 / 2×SSC）中處理，使染色體 DNA 變性，成為單鏈狀態(tài)，便于與探針雜交。處理溫度和時間需要嚴(yán)格控制，一般在 70 - 75℃處理數(shù)分鐘。
 

• 雜交反應(yīng)
  將標(biāo)記好的探針與預(yù)處理后的羊水細(xì)胞樣本混合，滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，在合適的雜交溫度（一般 37℃）下進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交反應(yīng)時間根據(jù)探針類型和長度不同而有所差異，一般需要數(shù)小時至過夜。在雜交過程中，探針與染色體上的目標(biāo) DNA 序列特異性結(jié)合。

 
（五）檢測與結(jié)果分析
 
1. 洗滌
雜交完成后，需要進(jìn)行嚴(yán)格的洗滌步驟，以去除未結(jié)合的探針。洗滌液一般采用不同濃度的 SSC 溶液和吐溫 - 20。通過逐步降低鹽濃度和溫和的洗滌劑作用，將非特異性結(jié)合的探針洗脫，而保留特異性結(jié)合的探針。
 

• 熒光顯微鏡觀察
  將洗滌后的載玻片在熒光顯微鏡下觀察。使用合適的濾光片來激發(fā)和檢測不同熒光標(biāo)記的信號。觀察細(xì)胞內(nèi)熒光信號的數(shù)量、位置和形態(tài)。對于染色體數(shù)目異常的診斷，根據(jù)特定染色體探針的熒光信號數(shù)量進(jìn)行判斷。例如，正常細(xì)胞中針對某條染色體的兩個熒光信號，若出現(xiàn)三個或更多，則提示該染色體數(shù)目異常。對于結(jié)構(gòu)異常，觀察熒光信號的分布和形態(tài)變化，如染色體易位可能導(dǎo)致兩個不同染色體的熒光信號在空間上出現(xiàn)異常的連接或融合。

 

• 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)
  建立嚴(yán)格的結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)非常重要。對于熒光信號的強(qiáng)度、清晰度和特異性都要有明確的界定。一般要求熒光信號明亮、清晰，與背景有明顯區(qū)別。同時，要對多個細(xì)胞進(jìn)行觀察和分析，以減少假陽性和假陰性結(jié)果。對于一些臨界結(jié)果，可能需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)或結(jié)合其他診斷方法進(jìn)一步確認(rèn)。

 

• FISH 技術(shù)在診斷染色體異常中的應(yīng)用

 
（一）常見染色體數(shù)目異常診斷
 
21 - 三體綜合征（唐氏綜合征）
使用 21 號染色體著絲粒探針進(jìn)行 FISH 檢測，可以快速準(zhǔn)確地檢測羊水細(xì)胞中的 21 - 三體情況。與傳統(tǒng)核型分析相比，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以在 24 - 48 小時內(nèi)得出結(jié)果，大大縮短了診斷時間。在臨床實(shí)踐中，對于高齡孕婦或唐篩高風(fēng)險孕婦的羊水樣本，F(xiàn)ISH 檢測為及時發(fā)現(xiàn) 21 - 三體胎兒提供了有力支持。
 
18 - 三體綜合征（愛德華茲綜合征）和 13 - 三體綜合征（帕陶綜合征）
類似地，針對 18 號和 13 號染色體的著絲粒探針也可用于檢測相應(yīng)的三體綜合征。這些染色體異常往往伴隨著嚴(yán)重的胎兒畸形和發(fā)育障礙，早期診斷可以為家庭和醫(yī)生提供決策依據(jù)，如是否選擇終止妊娠等。
 
（二）染色體結(jié)構(gòu)異常診斷
 
1. 染色體易位
對于一些攜帶染色體平衡易位的夫婦，其胎兒有一定的染色體異常風(fēng)險。通過使用特異性位點(diǎn)探針或全染色體涂抹探針，可以檢測羊水細(xì)胞中是否存在染色體易位情況。例如，在檢測羅伯遜易位時，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以清晰地顯示兩條近端著絲粒染色體之間的融合情況，幫助判斷胎兒是否遺傳了易位染色體，以及是否存在不平衡易位導(dǎo)致的基因缺失或重復(fù)。
 

• 染色體缺失和重復(fù)
  某些染色體微缺失和微重復(fù)綜合征（如 DiGeorge 綜合征、Prader - Willi 綜合征等）與特定染色體區(qū)域的基因缺失或重復(fù)有關(guān)。通過選擇覆蓋這些關(guān)鍵區(qū)域的探針，F(xiàn)ISH 技術(shù)可以檢測羊水細(xì)胞中是否存在相應(yīng)的染色體異常。這種檢測對于那些有家族遺傳病史或超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常的情況尤為重要。

 

• FISH 技術(shù)與傳統(tǒng)染色體核型分析的比較

 
（一）優(yōu)勢
 
1. 快速診斷
FISH 技術(shù)可以在短時間內(nèi)（一般 1 - 2 天）得出結(jié)果，而傳統(tǒng)核型分析需要較長時間（一般 7 - 14 天）。這對于孕周較大、需要盡快得到診斷結(jié)果的孕婦非常有利，可以及時采取相應(yīng)的措施。
 

• 特異性高
  由于使用的是特異性探針，F(xiàn)ISH 技術(shù)對于特定染色體異常的檢測具有很高的特異性。尤其是對于常見的三體綜合征等，其診斷準(zhǔn)確性與傳統(tǒng)核型分析相當(dāng)。

 

• 可檢測染色體微小異常
  對于一些染色體微缺失和微重復(fù)等微小結(jié)構(gòu)異常，F(xiàn)ISH 技術(shù)在選擇合適探針的情況下能夠進(jìn)行檢測，而傳統(tǒng)核型分析可能由于分辨率的限制而難以發(fā)現(xiàn)。

 
（二）局限性
 
1. 檢測范圍有限
FISH 技術(shù)只能檢測已知序列的特定染色體異常，需要根據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)的探針來進(jìn)行檢測。如果存在未知的染色體異�；蛱结樜锤采w的區(qū)域異常，則可能會漏診。而傳統(tǒng)核型分析可以對整個染色體組進(jìn)行全面觀察。
 

• 結(jié)果解讀相對復(fù)雜
  FISH 技術(shù)的結(jié)果解讀需要對熒光信號有準(zhǔn)確的判斷，對于一些信號不清晰或復(fù)雜的情況（如嵌合體等），解讀難度較大。而且不同實(shí)驗(yàn)室之間可能存在一定的結(jié)果判斷差異，需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作和解讀流程。

 

• 臨床案例分析

 
（一）病例資料
 
某孕婦，38 歲，孕 20 周，唐篩結(jié)果顯示 21 - 三體高風(fēng)險。超聲檢查發(fā)現(xiàn)胎兒頸部透明層增厚。經(jīng)羊膜腔穿刺獲取羊水樣本進(jìn)行 FISH 檢測和傳統(tǒng)核型分析。
 
（二）檢測過程與結(jié)果
 
1. FISH 檢測
使用 21 號染色體著絲粒探針進(jìn)行 FISH 檢測，在羊水細(xì)胞中觀察到三個明亮的熒光信號，提示 21 - 三體可能。整個 FISH 檢測過程在 24 小時內(nèi)完成。
 

• 傳統(tǒng)核型分析
  同時進(jìn)行的傳統(tǒng)核型分析在 10 天后得出結(jié)果，確診為 21 - 三體綜合征。

 
（三）討論
 
在這個案例中，F(xiàn)ISH 技術(shù)快速地為臨床提供了初步診斷結(jié)果，為后續(xù)的咨詢和決策提供了及時的信息。雖然傳統(tǒng)核型分析是確診的金標(biāo)準(zhǔn)，但 FISH 技術(shù)的快速診斷優(yōu)勢在這種情況下顯得尤為重要，可以避免孕婦長時間的焦慮等待。同時，兩者結(jié)果的一致性也證明了 FISH 技術(shù)在 21 - 三體診斷中的可靠性。
 
七、結(jié)論
 
熒光原位雜交技術(shù)在羊水細(xì)胞染色體異常診斷中具有重要的應(yīng)用價值。它以其快速、靈敏、特異性高的特點(diǎn)，為產(chǎn)前診斷染色體異常尤其是常見的三體綜合征和部分結(jié)構(gòu)異常提供了一種有效的檢測手段。雖然該技術(shù)存在一定的局限性，但與傳統(tǒng)染色體核型分析相結(jié)合，可以大大提高產(chǎn)前診斷的準(zhǔn)確性和效率。在臨床實(shí)踐中，應(yīng)根據(jù)孕婦的具體情況（如孕周、唐篩結(jié)果、超聲檢查結(jié)果等）合理選擇診斷方法，充分發(fā)揮 FISH 技術(shù)的優(yōu)勢，為降低染色體異�；純旱某錾�率、提高人口素質(zhì)做出貢獻(xiàn)。隨著 FISH 技術(shù)的不斷發(fā)展，如新型探針的開發(fā)、檢測流程的優(yōu)化等，其在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更加廣闊。同時，也需要進(jìn)一步加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和人員培訓(xùn)，以確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。