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顯微應(yīng)用 | 癌癥免疫學(xué)中的3D超多標(biāo)成像（上）

癌癥免疫學(xué)中的3D多標(biāo)記成像可更好地表征組織變化和細(xì)胞相互作用。本文介紹了一種在STELLARIS 共聚焦平臺上進(jìn)行3D成像的單次、超多標(biāo)工作流程，用于小鼠腫瘤組織成像。通過優(yōu)化成像設(shè)置和先進(jìn)的拆分技術(shù)，我們準(zhǔn)確地拆分了來自15種標(biāo)記物的信號，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型和功能狀態(tài)的精確識別。這種方法為癌癥研究提供了全面的工具，有助于深入理解腫瘤微環(huán)境。

在成像時保持染料的光譜重疊盡可能低至關(guān)重要，但在如此高密度的多標(biāo)記樣本中，串色無法完全避免。

在這種超多標(biāo)水平上，拆分工具提供了一種識別和量化每個標(biāo)記物貢獻(xiàn)的方法。

傳統(tǒng)方法中，單獨(dú)染色一個樣本（每個標(biāo)記物一個）作為拆分的對照和起點(diǎn)。對照樣本中獲取的信息用于構(gòu)建拆分矩陣。單染色方法比較繁瑣，因?yàn)檫@需要大量的樣本和精力，來創(chuàng)建與多重標(biāo)記數(shù)量相同數(shù)量的樣本。

圖2：超多標(biāo)實(shí)驗(yàn)中創(chuàng)建對照數(shù)據(jù)的新策略。a–c,腫瘤對照樣品（頂部）分別對5種不同標(biāo)記物進(jìn)行了部分染色，創(chuàng)建了3組標(biāo)記子集，以最小化串色可能的前提下涵蓋所需的15種染料對照（中間）。在成像工作流程中，對每組部分染色的樣本進(jìn)行全通道采集（目標(biāo)圖像，底部），這些圖像用于生成15標(biāo)拆分矩陣。

由于樣本通常稀缺且難以獲得， SpectraPlex提供了一種便利的節(jié)省樣本的替代方案：不用準(zhǔn)備一組單獨(dú)的單染色樣本，用戶會得到一組含有染料子集的對照樣本的制備建議。在我們的示例中，我們創(chuàng)建了一套三個組織切片，每個切片分別染色15標(biāo)面板中的5個標(biāo)記（即“Group”方法；圖2a–c，上方），并使用工作流程建議的設(shè)置進(jìn)行成像。結(jié)果顯示出無串色的5通道模板，可構(gòu)建拆分矩陣（圖2a–c，中間）。第二步，我們在同一視野內(nèi)使用推薦設(shè)置對完整的15標(biāo)通道進(jìn)行成像（圖2a–c，下方）。這兩步的信息用于創(chuàng)建整體拆分矩陣。

圖3：小鼠胰腺腫瘤切片的3D 15標(biāo)成像。a, 使用SpectraPlex功能對染色并拆分后的腫瘤切片進(jìn)行成像的概覽。比例尺：500 µm。b–g, 從15標(biāo)中提取的成像通道中的生物靶標(biāo)細(xì)節(jié)，以便于展示。比例尺：50 µm。b, 淋巴細(xì)胞：B220（薄荷綠色）、CD4（青色）和CD8（黃色）。c, T細(xì)胞及抗原，解析其功能狀態(tài)：CD4（青色）、CD8（黃色）、PD1（紫色）、FoxP3（白色）和TCF1（棕褐色）。d, 髓系細(xì)胞：CD11b（天藍(lán)色）、CD11c（紅色）和MHC II（棕色）。e, 增殖細(xì)胞和基質(zhì)抗原：Ki67 （深藍(lán)色）、α-SMA（橙色）和Tenascin C（森林綠色）。f, 癌上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞功能狀態(tài)：E-鈣 黏蛋白（玫瑰色）和MHC I（綠色）。周圍的細(xì)胞外基質(zhì)：Tenascin C（森林綠色）。g, 增殖細(xì)胞和成纖維細(xì)胞：Ki67（深藍(lán)色）和α-SMA（橙色）。血管內(nèi)皮細(xì)胞：CD31（柑橘綠色）。

計算出拆分矩陣后，使用相應(yīng)的設(shè)置對完整的15標(biāo)樣本進(jìn)行采集。拆分后的數(shù)據(jù)會自動生成（圖 3），并附上對應(yīng)的原始圖像，方便后續(xù)分析和解釋。帶有所有生物相關(guān)通道的樣本片段展示了單輪染色方法的豐富信息（圖3a）。

癌癥樣本的詳細(xì)視圖展示了不同的微環(huán)境。例如，富含淋巴細(xì)胞的區(qū)域（B 和T細(xì)胞）展示了免疫系統(tǒng)在腫瘤中已經(jīng)開始執(zhí)行功能（圖3b）。這些淋巴細(xì)胞大多具備免疫功能，直接或間接抵抗腫瘤生長（圖3c中TCF1和PD1的表達(dá)），其中部分細(xì)胞還具有調(diào)節(jié)作用（圖3c中FoxP3的 表達(dá)）。髓系細(xì)胞在腫瘤中通常更為常見，功能各異，可發(fā)揮抗腫瘤或促腫瘤作用，其空間分布在很小尺度上呈現(xiàn)顯著差異（圖3d）。

樣本中的癌癥、基質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)記物表現(xiàn)出較高的異質(zhì)性。雖然這些標(biāo)記物的分布較為復(fù)雜（例如，成纖維細(xì)胞的細(xì)胞過程），但它們也明顯覆蓋了大片上皮和內(nèi)皮細(xì)胞區(qū)域（圖3e–g）。高級拆分程序確保在組織內(nèi)準(zhǔn)確識別不同的細(xì)胞類型及其功能狀態(tài)（例如，免疫細(xì)胞亞型、組織決定因子和疾病決定因子）。

總體而言，建立一種穩(wěn)健、快速且靈活的3D成像方法以評估癌癥組織對于解析腫瘤微環(huán)境的變化至關(guān)重要。該成像工作流程的高效性可以加速結(jié)果評估、決策制定，并為后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計提供有力支持。

一次性成像方法為此工作流程帶來了兩項(xiàng)關(guān)鍵優(yōu)勢。首先，能夠?qū)εc癌癥標(biāo)記物相關(guān)的感興趣區(qū)域（ROIs）進(jìn)行深入探索，例如在不同放大倍數(shù)和更高分辨率下進(jìn)行更詳細(xì)的空間特征分析。其次，所有標(biāo)記物在三維環(huán)境中同時存在，確保在組織中發(fā)現(xiàn)的相互作用置于其預(yù)期或意料之外的組織微環(huán)境中進(jìn)行分析。

總結(jié)

本研究展示了15種標(biāo)記方法的成功應(yīng)用，并為推動癌癥研究提供了重要的工具，能夠更好地表征腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞類型和亞型、癌癥組織的免疫響應(yīng)以及對潛在治療的反應(yīng)。

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