熒光偏振成像通過測量樣品中熒光分子的偏振狀態(tài)，得到樣品的取向結(jié)構(gòu)特征，在生物學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。偏振成像常與其他熒光顯微技術(shù)結(jié)合，用來解析細(xì)胞結(jié)構(gòu)的排列方向、生物大分子的實時動態(tài)取向和組織的有序性等信息，以研究細(xì)胞的生理過程、藥物對細(xì)胞的作用及異常結(jié)構(gòu)的檢測。

北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程系的楊子儀團(tuán)隊發(fā)表文章，闡述了熒光偏振成像在生物學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，對利用偏振信息獲取不同樣品取向結(jié)構(gòu)的研究方法進(jìn)行分析比較，并對其未來發(fā)展趨勢進(jìn)行展望。

熒光偏振成像技術(shù)原理
熒光偏振成像在生物學(xué)研究中具有重要意義，它通過測量樣品內(nèi)熒光分子的偏振狀態(tài)，進(jìn)而獲取樣品的取向結(jié)構(gòu)特征。

熒光具有強(qiáng)度、波長、時間和偏振這四種特性，其中偏振方向與電場矢量方向一致。當(dāng)用線偏振光激發(fā)熒光偶極子時，光子的吸收概率與激發(fā)光場和偶極子方向夾角的余弦平方成正比；最終探測概率也與輻射光場方向和探測器方向夾角的余弦平方成正比。因此，通過對發(fā)射光場方向和強(qiáng)度的探測，能夠推斷出熒光偶極子的角度取向，從而進(jìn)一步研究樣品結(jié)構(gòu)特性，并且由于成像速度較快，該技術(shù)可用于活細(xì)胞樣本的實時取向和動態(tài)結(jié)構(gòu)分析。

主要的熒光偏振成像技術(shù)包括熒光各向異性（FA）、線性二向色性（LD）和散焦成像。這些技術(shù)能夠?qū)�樣品進(jìn)行單分子或?qū)拡龀上裼^測。單分子成像可獲取特定分子的取向和擺角，寬場成像則能得到一定區(qū)域內(nèi)多個探針的平均取向和平均擺角。

例如，熒光各向異性成像常采用圓偏振激發(fā)光，在探測光路中利用偏振分光棱鏡將發(fā)射熒光分解為不同方向，通過特定公式計算得到偶極子的取向特征；

線性二向色性成像利用偏振調(diào)制器產(chǎn)生不同方向的線偏振激發(fā)光，記錄熒光強(qiáng)度與激發(fā)光偏振態(tài)關(guān)系以獲取樣品取向信息；

散焦成像通過調(diào)節(jié)焦平面位置，根據(jù)物體散焦成像的雙瓣狀特征判斷偶極子取向，但該方法成像結(jié)果較模糊，對成像系統(tǒng)信噪比要求較高。

此外，熒光偏振技術(shù)還可與共聚焦、結(jié)構(gòu)光照明顯微等多種顯微技術(shù)相結(jié)合，在生物樣本成像時，需綜合考慮時間和空間分辨率等因素，權(quán)衡不同技術(shù)性能以滿足生物學(xué)問題的成像需求。

在生物學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用

一、馬達(dá)蛋白研究
馬達(dá)蛋白包含動力蛋白、驅(qū)動蛋白和肌球蛋白，在細(xì)胞內(nèi)利用ATP水解能量沿微管或肌動蛋白絲進(jìn)行機(jī)械運動，參與物質(zhì)運輸、有絲分裂等重要生物學(xué)動態(tài)過程。

熒光偏振成像在研究馬達(dá)蛋白動態(tài)方位角等性質(zhì)方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，有助于建立馬達(dá)蛋白步進(jìn)模型，對探究人體生命活動和馬達(dá)蛋白異常相關(guān)疾病意義重大。

例如，Goldman課題組在2017年運用熒光偏振全內(nèi)反射顯微技術(shù)（polTIRF），將量子納米棒連接在動力蛋白多肽部分環(huán)結(jié)構(gòu)上進(jìn)行成像，測量其在微管步進(jìn)時環(huán)結(jié)構(gòu)的位置與3D方位角變化，發(fā)現(xiàn)平均角度變化約為8°，與步長大小弱相關(guān)、與ATP濃度無關(guān)，進(jìn)而提出基于桿的彎曲和鉸接的新動力學(xué)模型。

對于驅(qū)動蛋白，Moerner課題組在2001年比較不同熒光探針標(biāo)記效果并利用線性二色性熒光偏振顯微鏡研究其沿微管的取向性；Goldstein課題組同年運用熒光偏振技術(shù)測量驅(qū)動蛋白在不同核苷酸狀態(tài)下的熒光偏振比，推斷其取向靈活性并提出能量供應(yīng)下的步進(jìn)模型；Sosa課題組在2003年將研究推廣至二聚體，標(biāo)記驅(qū)動蛋白二聚體研究ATP水解過程中兩個馬達(dá)結(jié)構(gòu)域的取向和相對構(gòu)型，2009年又對ATP等待狀態(tài)下的驅(qū)動蛋白進(jìn)行標(biāo)記和偏振成像，補(bǔ)充了能量供應(yīng)下的驅(qū)動蛋白步進(jìn)模型。

在肌球蛋白研究方面，Selvin課題組于2006年通過聚焦和散焦成像測量肌球蛋白V分子的3D取向和步進(jìn)行為；Goldman課題組在2007年運用polTIRF技術(shù)研究肌球蛋白步進(jìn)時與肌動蛋白絲的三維旋轉(zhuǎn)角度關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其運動區(qū)域和杠桿臂間存在柔性區(qū)域；2008年該課題組又用羅丹明標(biāo)記肌動蛋白絲，測量肌球蛋白II和V步進(jìn)時肌動蛋白絲繞軸旋轉(zhuǎn)的方位角變化，探討其旋轉(zhuǎn)機(jī)制；2012年Yanagida課題組用高熒光量子棒標(biāo)記肌球蛋白 V，研究其沿肌動蛋白絲運動與繞自身軸旋轉(zhuǎn)角度關(guān)系，得出每步進(jìn)一次繞自身軸旋轉(zhuǎn)約90°的結(jié)論；2013年Goldman課題組利用時間相關(guān)的單光子計數(shù)技術(shù)，以高時間分辨率的polTIRF顯微鏡更精確地研究肌球蛋白的擺動特征。

二、細(xì)胞膜研究
膜結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化
生物膜作為磷脂雙分子層，包含膽固醇和多種蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)對物質(zhì)運輸、信息交換和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)等生命過程至關(guān)重要。熒光偏振可通過探針取向各向異性等參數(shù)反映膜結(jié)構(gòu)形態(tài)及信號傳導(dǎo)變化，為深入理解生物學(xué)機(jī)理提供依據(jù)。

眾多技術(shù)手段被應(yīng)用于該領(lǐng)域研究。2003年，Piston課題組使用標(biāo)記GFP的MHC蛋白，通過激光掃描顯微鏡測量計算穩(wěn)態(tài)各向異性，確定GFP和MHC單邊剛性連接位置，并研究MCMV肽片段裝載對各向異性的影響，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

2004年，Almers課題組運用全內(nèi)反射顯微鏡，以正交方向偏振光激發(fā)樣品觀測熒光強(qiáng)度，根據(jù)s和p激發(fā)下的熒光強(qiáng)度變化研究染料在質(zhì)膜中的擴(kuò)散，輔助探究胞吐過程中的膜融合。

2010年，Anantharam課題組以di標(biāo)記質(zhì)膜，采用偏振全內(nèi)反射熒光顯微鏡進(jìn)行高時空分辨率成像，觀察質(zhì)膜胞吐與內(nèi)吞時偏振參數(shù)的改變，研究質(zhì)膜拓?fù)湫螒B(tài)變化及相關(guān)蛋白在胞吐中的作用。

2011年，Brasselet課題組利用共聚焦熒光偏振顯微成像技術(shù)，用GFP和di-8-ANEPPQ標(biāo)記細(xì)胞膜蛋白MHCI和脂質(zhì)，加入改變細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的藥物，通過測量藥物作用前后的偏振度推測擺角范圍變化，研究細(xì)胞骨架對細(xì)胞膜形態(tài)的作用。

2013年，Brasselet課題組在前期研究基礎(chǔ)上，利用傅里葉分析開發(fā)高精度共聚焦顯微技術(shù)，以不同親脂性探針標(biāo)記脂質(zhì)膜，研究膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)在細(xì)胞骨架受影響和膽固醇消耗時的變化。

2022年，Lew課題組將偏振調(diào)制和光瞳分離技術(shù)結(jié)合，開發(fā)出高分辨率顯微技術(shù)，以尼羅河紅為探針標(biāo)記脂質(zhì)膜，通過不同通道強(qiáng)度反映偶極子相關(guān)信息，高精度研究膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)及流動性。

雙光子熒光偏振技術(shù)也廣泛應(yīng)用于膜結(jié)構(gòu)研究，如2005年French課題組用標(biāo)記在膜不同方向的探針，運用雙光子熒光偏振顯微鏡研究膜納米管結(jié)構(gòu)及膽固醇消耗對膜結(jié)構(gòu)的影響；2009年Onfelt課題組使用雙光子顯微鏡，通過歸一化偏振參數(shù)反映探針有序性，測量自然殺傷細(xì)胞形成免疫突觸期間的偏振參數(shù)，研究其細(xì)胞膜褶皺程度；2011年Lazar課題組運用具有較高線性二色性的雙光子熒光偏振顯微技術(shù)觀察膜結(jié)構(gòu)，研究G蛋白與其受體作用及鈣離子濃度引起的鈣傳感器構(gòu)象變化；2014 年Brasselet課題組運用可調(diào)線性二色性的雙光子熒光偏振顯微鏡，開發(fā)數(shù)據(jù)分析方法，獲取細(xì)胞膜上探針更精確的取向分布。

散焦成像技術(shù)同樣在膜結(jié)構(gòu)研究中有應(yīng)用，2008年Dunn課題組通過散焦成像測量熒光脂質(zhì)類似物在DPPC薄膜中的取向，發(fā)現(xiàn)其傾斜方向?qū)Ρ砻鎵毫Φ牟煌�影響及膽固醇對脂膜有序性的作用�?013年Dunn課題組揭示GM1對脂膜特性的顯著影響，如添加微量GM1會導(dǎo)致脂膜膨脹。

膜相變化
隨著對膜結(jié)構(gòu)認(rèn)識的深入，膜的流動鑲嵌模型逐漸發(fā)展為更復(fù)雜的多相系統(tǒng)模型。熒光偏振可用于測量膜的總體取向，分析不同液相結(jié)構(gòu)的有序性。

例如，2001年Baird課題組用脂質(zhì)探針標(biāo)記膜結(jié)構(gòu)，測量不同膽固醇濃度下的熒光各向異性，研究膽固醇對脂質(zhì)有序性的作用及脂質(zhì)筏在細(xì)胞膜中的存在比例。2008年Marques課題組采用雙光子熒光偏振結(jié)合熒光壽命顯微技術(shù)，用特定探針標(biāo)記不同膜相構(gòu)成的囊泡，測量探針熒光強(qiáng)度隨囊泡輪廓角度的變化，建立不同相中探針取向勢能模型。2009年Yip課題組運用熒光偏振全內(nèi)反射顯微鏡和原子力顯微鏡聯(lián)合成像，用多種探針標(biāo)記膜結(jié)構(gòu)，研究加入物質(zhì)后膜相區(qū)域分布及分子有序性變化，探究膜破裂機(jī)制。2020年Lew課題組將單分子取向定位顯微鏡用于膜相分析，通過探針擺角取向范圍區(qū)分不同膜相，并測量酶對膜相的改變，且該技術(shù)相比SMLM成像具有不受探針與膜結(jié)合時間影響和更高對比度的優(yōu)勢。

三、DNA研究
DNA作為人體主要遺傳物質(zhì)，其構(gòu)象特征對基因表達(dá)調(diào)控有重要作用，除常見雙螺旋結(jié)構(gòu)外，還存在其他構(gòu)型。熒光偏振可用于測量DNA鏈的結(jié)構(gòu)取向，對藥物設(shè)計極具價值。

2009年，汪海林課題組應(yīng)用熒光偏振，通過正交偏振方向熒光強(qiáng)度相減去除未標(biāo)記熒光染料影響，檢測基因組甲基化水平。2016年，Moerner課題組以類似PAINT方法用λ噬菌體DNA進(jìn)行體外研究，獲得高分辨率偏振圖像，明確SYTOX染料相對于非插層染料的標(biāo)記模式，探究DNA鏈構(gòu)象。

2019年，席鵬課題組開發(fā)偏振結(jié)構(gòu)光照明顯微（pSIM）技術(shù)提高偏振成像分辨率，用SYTOX垂直插入標(biāo)記DNA，清晰測量DNA細(xì)絲取向。2019年，Peterman課題組采用花青素嵌入劑標(biāo)記DNA，結(jié)合寬場熒光偏振顯微鏡和光鑷技術(shù)，測量DNA鏈?zhǔn)芾�伸時的偏振參數(shù)，通過建模擬合分析不同階段分子平均取向和擺角半徑，為S-DNA形成提供證據(jù)；2021年該課題組進(jìn)一步觀察過度拉伸DNA的結(jié)構(gòu)特征，證實P-DNA主要在富含A-T堿基對序列中形成，證明熒光偏振顯微鏡和DNA力譜相結(jié)合是研究過度拉伸DNA納米級結(jié)構(gòu)特征的有力手段。

四、細(xì)胞骨架研究
細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞維持形態(tài)的重要結(jié)構(gòu)，由微管、微絲、中間纖維和Septin等組成，熒光偏振顯微技術(shù)為觀察其結(jié)構(gòu)及動力學(xué)變化提供新途徑。

Septin：在釀酒酵母芽殖過程中，其結(jié)構(gòu)動態(tài)變化備受關(guān)注。2006年，Vrabioiu和Mitchison使用septin-GFP融合體基因取代內(nèi)源性基因，利用熒光偏振顯微鏡觀察到從沙漏到環(huán)狀轉(zhuǎn)變時，septin細(xì)絲在膜平面旋轉(zhuǎn)90°且整體形態(tài)構(gòu)成圓周。2011年，DeMay課題組開創(chuàng)LC-PolScope技術(shù)，分析septin-GFP在酵母出芽過程中的取向變化，證實其高度組織化且與芽頸關(guān)系密切，明確芽殖酵母頸部區(qū)域septin-GFP的結(jié)構(gòu)動力學(xué)。2015年，Abrahamsson課題組用多焦點偏振顯微鏡同時收集三維空間信息，分析胞質(zhì)分裂時septin的重新排布，且可長時間成像酵母細(xì)胞。2016年，Mehta課題組使用瞬時熒光偏振顯微鏡，以單分子靈敏度和100ms時間分辨率成像活細(xì)胞中熒光團(tuán)，追蹤septin-conGFP顆粒位置和取向，確定其動力學(xué)特征。

微絲：由肌動蛋白螺旋狀聚合而成，在細(xì)胞活動中作用顯著。2016年，Brasselet組利用偏振分辨直接隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡研究固定細(xì)胞中的肌動蛋白應(yīng)力纖維，發(fā)現(xiàn)不同染料標(biāo)記下與纖維方向的關(guān)系，證明該技術(shù)可作為定量指標(biāo)觀察細(xì)胞形狀變化中肌動蛋白絲重組。同年，Mehta課題組使用瞬時熒光偏振顯微鏡和跟蹤算法，分析活細(xì)胞中肌動蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)動力學(xué)和肌動蛋白絲分子取向。2019年，高軍濤課題組采用基于組稀疏性的超分辨偶極子定向映射方法，發(fā)現(xiàn)肌動蛋白細(xì)絲中熒光分子偶極取向與細(xì)絲方向關(guān)系及在交叉處的三維共定位。2023年，席鵬課題組開發(fā)高速自偏振同步調(diào)制三維結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡，利用相關(guān)技術(shù)優(yōu)勢，準(zhǔn)確分辨肌動蛋白絲取向分布。

微管：由微管蛋白和微管結(jié)合蛋白組成，結(jié)構(gòu)特性重要。2014年，Walla課題組使用偏振解調(diào)超分辨技術(shù)和激發(fā)偏振角縮窄技術(shù)，觀察固定PtK2細(xì)胞中微管纖維細(xì)節(jié)，反映微管周圍螺旋結(jié)構(gòu)。2019年，席鵬課題組利用偏振光結(jié)構(gòu)光顯微技術(shù)對活U2OS細(xì)胞中微管成像，成功觀測偶極子方向動態(tài)變化，證實該技術(shù)可用于活細(xì)胞成像且分辨率優(yōu)勢明顯。

其他應(yīng)用領(lǐng)域

核孔復(fù)合物
核孔復(fù)合物是嵌入核膜孔隙的大型蛋白通道，介導(dǎo)核質(zhì)運輸。晶體學(xué)和單粒子電子顯微鏡雖能獲取部分核孔蛋白高分辨率結(jié)構(gòu)，但無法解決其排列等問題。2010年，Mattheyses課題組利用大分子復(fù)合體對稱性和組織結(jié)構(gòu)，開創(chuàng)熒光各向異性方法，用GFP標(biāo)記核孔蛋白，觀察活酵母中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域有序或無序狀態(tài)，揭示個別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域物理排列信息及核孔結(jié)構(gòu)動態(tài)變化，明確剛性和柔性結(jié)構(gòu)域特征。2011年，Kampmann課題組提出用偏振熒光顯微鏡研究活酵母和哺乳動物細(xì)胞中核孔蛋白方向的方法，結(jié)果符合公認(rèn)模型。

海馬神經(jīng)元
其結(jié)構(gòu)精細(xì)，研究其結(jié)構(gòu)有助于理解神經(jīng)系統(tǒng)功能。2014年，Hafi課題組使用偏振解調(diào)超分辨和激發(fā)偏振角縮窄技術(shù)，對海馬神經(jīng)元棘成像，實現(xiàn)寬視場成像且穿透深度優(yōu)于基于TIRF的方法，雙光子激發(fā)時穿透深度更大。2016年，席鵬課題組將稀疏反卷積和最小二乘估計應(yīng)用于熒光偏振調(diào)制數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)海馬神經(jīng)元樹突棘頸偶極子取向非均勻分布，表明可能存在雙膜結(jié)構(gòu)且頸部兩側(cè)熒光分子取向形態(tài)有差異。2022年，清華大學(xué)高軍濤課題組使用光學(xué)鎖定檢測超分辨偶極子定向映射技術(shù)，觀察到活體神經(jīng)元樹突棘擴(kuò)張和收縮的各向異性變化，揭示其形態(tài)和方向動態(tài)，推動突觸活動研究。

巨噬細(xì)胞
在機(jī)體生理過程中作用關(guān)鍵，與多種疾病相關(guān)。2018年，席鵬課題組通過散焦分析確認(rèn)SERS納米棒的各向異性效應(yīng)，在巨噬細(xì)胞中用其標(biāo)記囊泡，實現(xiàn)亞衍射分辨率成像，動態(tài)跟蹤記錄軌跡和方向信息，揭示亞細(xì)胞器超微結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞力
對生物過程不可或缺，獲取細(xì)胞力信息有助于理解生命活動機(jī)制。2018年，Salaita課題組利用分子張力探針和熒光偏振顯微鏡測量小鼠成纖維細(xì)胞和人血小板中細(xì)胞力大小和3D方向，繪制牽引力方向，發(fā)現(xiàn)血小板受力結(jié)構(gòu)與受力方向一致性及凝塊結(jié)構(gòu)和力學(xué)特征的各向異性和空間異質(zhì)性。

聚合物動力學(xué)
聚合物行為復(fù)雜，其物理性質(zhì)和動力學(xué)機(jī)制有待深入理解。散焦成像可同時觀察眾多分子，為研究聚合物分子旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散提供可能。2004年，Enderlein課題組通過散焦寬場成像探測單個分子發(fā)射模式變化，為相關(guān)跳躍模型提供證據(jù)。2006年，該課題組跟蹤分子在玻璃聚合物薄膜中的3D旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散，觀察到多組分旋轉(zhuǎn)擴(kuò)散衰減，反映聚合物不同弛豫狀態(tài)和局部環(huán)境快速變化。

纖維素酶
提升其酶效率對生物燃料生產(chǎn)意義重大，研究其與底物相互作用及動力學(xué)機(jī)制有助于優(yōu)化生物燃料生產(chǎn)。2011年，Smith課題組通過單分子熒光散焦成像，觀察到單個碳水化合物結(jié)合塊與結(jié)晶纖維素在水環(huán)境中的位點特異性結(jié)合，明確結(jié)合方向，為結(jié)合機(jī)制提供原位物理證據(jù)。

結(jié)論與展望
熒光偏振顯微成像技術(shù)利用熒光分子偶極取向信息研究生物結(jié)構(gòu)，能揭示分子取向，提供比傳統(tǒng)熒光成像更多信息，在解析復(fù)雜生物大分子結(jié)構(gòu)和還原生命活動動態(tài)過程方面應(yīng)用廣泛，且可與多種成像模式結(jié)合，為超分辨熒光成像提供思路和幫助，如開創(chuàng)超分辨熒光偏振顯微技術(shù)，提供高分辨率和詳細(xì)取向信息的成像結(jié)果。

展望未來，該技術(shù)有望進(jìn)一步發(fā)展。自適應(yīng)光學(xué)可校正像差，在3D偶極子信息提取或深層組織矢量成像中發(fā)揮重要作用；無標(biāo)記偏振顯微鏡可與熒光偏振顯微技術(shù)互補(bǔ)，獲取更多微觀結(jié)構(gòu)信息；光電關(guān)聯(lián)顯微技術(shù)結(jié)合多種技術(shù)優(yōu)點，可提供高分辨率細(xì)胞環(huán)境特定事件成像，熒光偏振顯微技術(shù)與之結(jié)合有望提升成像效果；與電子顯微鏡結(jié)合可為生物學(xué)家提供更有效的研究工具；同時，該技術(shù)在分辨率和偏振信息分析能力方面將不斷優(yōu)化，在生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮更廣泛有效的應(yīng)用。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來源于：楊子儀,李世晗,劉芷如,鐘素藝,李美琪,席鵬.熒光偏振成像技術(shù)及其生物學(xué)應(yīng)用[J].激光與光電子學(xué)進(jìn)展,2024, 61(18):1800001.Ziyi Yang,Shihan Li,Zhiru Liu,Suyi Zhong,Meiqi Li,Peng Xi.Biological Applications of Fluorescence Polarization Imaging[J].Laser & Optoelectronics Progress,2024,61(18): 1800001.