本研究旨在揭示 AF 患者的免疫細胞生理變化，通過隊列研究闡明特異性免疫細胞亞群與導管消融術后 AF 的發(fā)生率和復發(fā)之間的關系，并探討其潛在的機制。

研究方法：
本文采用熒光標測技術（Optical Mapping）來檢測 Control 組和實驗組的動作電位以及鈣瞬變信號，包括動作電位時程、傳導速度、有效不應期以及鈣瞬變交替等指標。

研究結(jié)果：
1. AF 中免疫細胞的轉(zhuǎn)錄特性和異質(zhì)性
為了驗證 AF 中免疫細胞的變化，對從 AF 患者和非 AF 患者中分離出來的外周血單核細胞（PBMCs）進行了單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）分析。在進行整合和可視化后，得到 6 個亞群：B 細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、單核細胞、自然殺傷（NK）細胞和其他 T 細胞。然后，對每個亞群子集中前 50 個差異表達基因 (DEGs)  進行基因本體論（GO）富集分析。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，AF 患者的亞群比例和基因的表達水平發(fā)生了一些變化。值得注意的是，CD4+ T細胞和 CD8+ T 細胞的比例變化是最顯著的。因此，提取這兩個子集進行進一步的分析。
 

圖1. AF 中免疫細胞的轉(zhuǎn)錄特性和異質(zhì)性
 

2. AF 相關細胞亞群的識別和特征
基于不同的基因表達模式，CD4+ T 細胞和CD8+ T 細胞被進一步分為 20 個亞群，而在 AF 中有一個明顯的異質(zhì)性亞群，其中大部分為效應記憶 CD8+ T 細胞。此外，AF 組中 CD8+ T 細胞數(shù)量增加。GO 富集分析顯示，AF 的特征基因集在 AF 進展中發(fā)揮的作用相似。通過構建所有 CD8+ T 細胞的偽時間軌跡，鑒定出 AF 相關亞群都位于該軌跡的末端，表明這些細胞是衰老的 CD8+ T 細胞。與此分析一致的是，這些細胞中免疫細胞衰老的標志基因 CD57（B3GAT1）和 KLRG1 表達上調(diào)，而 CD27 或 CD28 的表達下降。假時間順序熱圖顯示，大部分上調(diào)的基因與 T 細胞的激活和細胞因子的產(chǎn)生有關。此外，衰老細胞中各種細胞毒性、趨化性和炎癥相關因子的表達均上調(diào)。綜上所述，提示衰老的 CD8+ T 細胞可能促進 AF 的發(fā)展。

圖2. AF 相關免疫細胞亞群的鑒定
 

 

3. 衰老的 CD8+ T 細胞與房顫發(fā)病率之間的關系
為了進一步驗證衰老的 CD8+ T 細胞與 AF 發(fā)病率之間的關系，應用流式細胞術檢測得到房顫患者的衰老 CD8+ T 細胞數(shù)量顯著增加，這一結(jié)果與 scRNA-seq 檢測結(jié)果一致。

圖4. 衰老的 CD8+ T 細胞與 AF 發(fā)病率相關

4. 衰老 CD8+ T 細胞與 AF 預后的關系
在本研究中，26.8% 的患者在術后 10 個月內(nèi)出現(xiàn)房顫復發(fā)的現(xiàn)象。通過流式細胞術檢測發(fā)現(xiàn)術后復發(fā)性房顫患者的外周血和左心房血中衰老的CD8+ T 細胞數(shù)量顯著增加。此外，Cox 比例風險模型顯示，衰老 CD8+ T 細胞百分比的升高是預測 AF 復發(fā)的關鍵指標。

圖5. 衰老的 CD8+ T 細胞與 AF 的預后相關
 

5. 衰老的 CD8+ T 細胞在 AF 中顯示出 IFN-γ 的產(chǎn)生增加
為了了解衰老細胞的基本病理特征，構建了蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn) IFN-γ 為衰老相關分泌表型（SASP）的主要組成成分�；�因集富集分析（GSEA）結(jié)果表明 IFN-γ 相關信號通路的表達顯著上調(diào)。這些結(jié)果證明，IFN-γ 表達增加是 AF患者衰老 CD8+ T 細胞的細胞因子分泌譜中最重要的改變。

6. IFN-γ 增加可誘導 Ca²⁺ 處理異常，并增強房顫易感性通過免疫熒光檢測和 scRNA-seq 分析發(fā)現(xiàn) AF 患者有更多的衰老 CD8⁺ T 細胞出現(xiàn)纖維化。當將 hiPSC-AMs 暴露于培養(yǎng)的衰老 CD8⁺ T 細胞上清液時，Ca²⁺ 火花的頻率明顯增加，而應用IFN-γ 中和抗體可以有效地降低火花的頻率。這提示，IFN-γ 誘導衰老 CD8⁺ T 細胞的 Ca²⁺ 失調(diào)。為了進一步闡明 IFN-γ 在房顫易感性中的潛在作用，我們對大鼠的心臟進行了熒光標測。雖然 IFN-γ 灌注沒有顯著改變心房有效不應期（AERP）和動作電位時程（APD），但它導致了傳導速度的降低。此外，IFN-γ 灌注后出現(xiàn)了電交替和鈣瞬變交替等典型的心律失�，F(xiàn)象，同時使 AF 的誘發(fā)率增加且持續(xù)時間延長。