表面等離子體共振 (SPR) 是一種廣泛使用的無標(biāo)記互作檢測(cè)技術(shù)，用于研究生物分子的結(jié)合行為。自 20 世紀(jì) 90 年代商業(yè)化 ^[1] 以來，SPR 在技術(shù)開發(fā)和應(yīng)用方面都取得了巨大進(jìn)步。它已成為生物醫(yī)學(xué)研究、生物傳感器開發(fā)和藥物發(fā)現(xiàn)的核心工具。在過去十年中，SPR 還與其他技術(shù)結(jié)合聯(lián)用，例如電化學(xué) (EC-SPR) ^[2]、液相色譜 (HPLC) 和質(zhì)譜 (SPR-MS) ^[3]，并已用于氣相痕量檢測(cè)（SPR-氣相檢測(cè)）。近年來最重要的發(fā)展之一是 SPR Microscopy (SPRM)，這是一種將高分辨率光學(xué)顯微鏡與表面等離子共振相結(jié)合的技術(shù)。SPRM 兼具兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，可直接對(duì)樣品進(jìn)行空間可視化定位分析，并實(shí)時(shí)測(cè)量結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)。利用傳統(tǒng)的（基于通道的）SPR技術(shù)，研究細(xì)胞膜蛋白與候選藥物或其他配體的結(jié)合一直具有挑戰(zhàn)性，因?yàn)閺募?xì)胞中提取蛋白并將純化的蛋白固定在 SPR 傳感器上不僅耗時(shí)費(fèi)力，而且改變了蛋白質(zhì)的天然微環(huán)境。SPRM 通過將細(xì)胞直接固定在 SPR 傳感器上，從而保持了蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)，顯著改善了此類測(cè)量的結(jié)果 ^[4]。此外，還可以確定和繪制每個(gè)細(xì)胞中膜蛋白的分布和局部結(jié)合活性。

在本技術(shù)說明中，著重介紹 SPRM 技術(shù)及其與傳統(tǒng) SPR 技術(shù)的比較。

1 傳統(tǒng)（基于通道）SPR
基于流體通道的SPR檢測(cè)模式是最常見的分子結(jié)合研究方法（圖 1）。傳感器頂部安裝有多個(gè)通道的微流控模塊，樣品通過泵系統(tǒng)傳輸送到每個(gè)通道。配體分子被固定在每個(gè)通道的傳感區(qū)域上，隨后分析物分子被傳輸?shù)矫總�(gè)通道中與特定配體結(jié)合。對(duì)每個(gè)通道的傳感區(qū)域（紫色區(qū)域）的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均，以產(chǎn)生 SPR 傳感圖（如圖 1 右側(cè)所示）。每個(gè)通道在一次測(cè)量循環(huán)中都會(huì)生成一個(gè)傳感圖（或表面再生后的多個(gè)傳感圖），結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)可從這些傳感圖中分析得出。
 

圖 1 傳統(tǒng)（基于通道）SPR模式

2 SPRM（高分辨率顯微鏡）
SPRM 是一種基于高分辨率成像的 SPR 模式。它提供明場(chǎng)光學(xué)圖像和傳感區(qū)域的 SPR 數(shù)據(jù)（親和力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)）（圖 2）。SPRM（例如 SPRm200）在圖像的每個(gè)像素處生成一個(gè) SPR 傳感圖，提供任何給定傳感區(qū)域上結(jié)合事件的空間映射，并提供比傳統(tǒng) SPR 模式更多的信息。SPRM 不僅可用于傳統(tǒng)的 SPR 結(jié)合分析測(cè)量，還可用于細(xì)胞對(duì)候選藥物反應(yīng)的異質(zhì)性研究。由于其高空間分辨率（~ 1 µm），它可以監(jiān)測(cè)和測(cè)量病毒、細(xì)菌的結(jié)合事件，而這些無法通過傳統(tǒng) SPR 模式直接測(cè)量。SPRM 在測(cè)量藥物與天然狀態(tài)下的膜蛋白相互作用方面尤其有效，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子位于活細(xì)胞膜內(nèi)。
 

圖 2 基于高分辨率成像的SPR模式

細(xì)胞在傳感器表面孵育或固定，分析物或藥物分子被傳輸?shù)絺鞲袇^(qū)域。圖 3 顯示了傳感器上藥物分子與細(xì)胞之間相互作用的示例。實(shí)時(shí) SPR 圖像 (3B，藍(lán)色圖像) 表示細(xì)胞受體與藥物分子的相互作用或結(jié)合反應(yīng) (粉紅色區(qū)域)。通過明場(chǎng)圖像 (3A，綠色圖像) 選擇感興趣的區(qū)域，生成傳感圖 (3C) 并分析得出結(jié)合信息。當(dāng)選擇許多不同的細(xì)胞區(qū)域時(shí)，可以用具有統(tǒng)計(jì)意義的數(shù)據(jù)確定細(xì)胞和細(xì)胞膜的異質(zhì)性。
 

圖 3 SPRM 同時(shí)提供明場(chǎng)圖像 (A) 和 SPR 圖像 (B)。結(jié)合參數(shù)由傳感圖 (C) 得出

總之，SPRM 提供了一種獨(dú)特的功能來可視化細(xì)胞膜的結(jié)合活性。與傳統(tǒng)的基于通道的 SPR 模式相比，SPRM 還具有額外的優(yōu)勢(shì)，即可以通過空間映射細(xì)胞膜蛋白天然狀態(tài)下的結(jié)合親和力和動(dòng)力學(xué)，從而提供更多生物學(xué)相關(guān)信息。由于其高空間分辨率，SPRM 可用于監(jiān)測(cè)其他表面發(fā)生過程，例如標(biāo)記有生物分子的納米顆粒的結(jié)合或納米顆粒包被藥物的遞送。

3 SPRM與SPR要點(diǎn)比較

4 SPRM 200介紹
SPRM 200是美國(guó)BI公司細(xì)胞原位分子互作動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)

應(yīng)用
小分子藥物或抗體藥物與細(xì)胞膜蛋白（受體、離子通道等）原位結(jié)合分析；抗體藥物與單細(xì)胞或多細(xì)胞的結(jié)合篩選；細(xì)胞結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)分布分析，開展細(xì)胞異質(zhì)性研究；細(xì)菌或病毒與抗性藥物的相互作用；其他分子與細(xì)胞/活細(xì)胞層面原位相互作用研究。

功能
親和力測(cè)定；動(dòng)力學(xué)分析；同步于SPR測(cè)量的光學(xué)成像；藥物對(duì)多細(xì)胞或單細(xì)胞作用的研究；細(xì)菌或病毒與抗性藥物相互作用的納米級(jí)觀察。

特點(diǎn)

• 無標(biāo)記
• 實(shí)時(shí)定量
• 細(xì)胞膜蛋白原位分析
• 細(xì)胞膜上指定區(qū)域分析
• 細(xì)胞或細(xì)胞膜異質(zhì)性研究
• 電化學(xué)聯(lián)合分析

參考文獻(xiàn)
1. Liedberg, B et al, Biosens. Bioelectron. 10, i-ix, 1995
2. Patskovsky, S et al, Analyst, 139, 596-602, 2014
3. Nedelkov, D and Nelson, R, Trends in Biotechnology, 21, 7, 301-305, 2004
4. Wang, W et al, Nature Chemistry, 3, 249-255, 2011