使用光片顯微鏡進(jìn)行人類(lèi)早期大腦類(lèi)器官發(fā)育的形態(tài)動(dòng)力學(xué)研究
在本例中，作者建立了長(zhǎng)期的活體光片顯微鏡技術(shù)，應(yīng)用于由熒光標(biāo)記的人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞生成的無(wú)指導(dǎo)腦類(lèi)器官，這使得我們能夠在類(lèi)器官發(fā)育的數(shù)周內(nèi)跟蹤組織形態(tài)、細(xì)胞行為和亞細(xì)胞特征，為研究人類(lèi)大腦形態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了新的途徑，并支持基質(zhì)相關(guān)的機(jī)械感知?jiǎng)討B(tài)在大腦區(qū)域化過(guò)程中發(fā)揮核心作用的觀(guān)點(diǎn)。
稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類(lèi)器官的
長(zhǎng)期活體成像
01、類(lèi)器官的培養(yǎng)
本研究中使用的細(xì)胞系為：
❖Histone2B-mEGFP 均勻標(biāo)記細(xì)胞核
❖mEGFP-Beta-Actin 均勻標(biāo)記 ACTB
❖mTagRFP–T–CAAX 標(biāo)記細(xì)胞膜
❖mTagRFP–T-LaminB1 標(biāo)記 LMNB1
❖未標(biāo)記的 WTC iPSCs
操作流程：
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干細(xì)胞系按標(biāo)準(zhǔn)流程培養(yǎng)和傳代
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96孔板，每孔加入500個(gè)細(xì)胞/3000個(gè)細(xì)胞，在 mTSR+中（加入1:200 ROCKi和1:200Pen-strep），并以 200g離心5分鐘以生成胚體（EBs）
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在第 2 天更換新鮮的 mTSR+，加入1:200 ROCKi 和 1:200 Pen-strep
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第 4 天提供含 2%溶解的 matrigel 的新鮮神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基，并每隔一天更換一次
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第 10 天提供含 2% matrigel 的分化培養(yǎng)基-VitA，并在第 15 天提供含 1% matrigel 的分化培養(yǎng)基+ VitA
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第 15 天將類(lèi)器官轉(zhuǎn)移到 24 孔板中，每孔一個(gè)類(lèi)器官，并轉(zhuǎn)移到搖床上，隨后在一個(gè)月時(shí)將每孔一個(gè)類(lèi)器官轉(zhuǎn)移到 6 孔板中，并保持在搖床上
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嵌入基質(zhì)膠中，并培養(yǎng)在樣本室微孔中的細(xì)胞球用于光片成像
02、長(zhǎng)期活體成像觀(guān)察
胚胎體（4 個(gè)）嵌入溶解在神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的 20-50%基質(zhì)膠中或覆蓋在 0.6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖上。
圖2.稀疏和多位點(diǎn)熒光標(biāo)記腦類(lèi)器官的長(zhǎng)期活體成像.f、4 個(gè)不同類(lèi)器官（第 15 天）的 3D 投影（左）和橫截面（右），用全切片熒光原位雜交鏈反應(yīng)（HCR）染色標(biāo)記轉(zhuǎn)錄本。比例，100 微米。g) 從 188 小時(shí)成像實(shí)驗(yàn)中 75 小時(shí)成像的最大投影圖像。類(lèi)器官包含 5 種不同的細(xì)胞系，這些細(xì)胞系具有穩(wěn)定的蛋白質(zhì)遺傳標(biāo)記，使用紅色或綠色熒光蛋白（RFP，GFP），以及未標(biāo)記的細(xì)胞。比例，100 微米。h) 組織器切片（84 小時(shí)）顯示核膜（Lamin，RFP，品紅色）、質(zhì)膜標(biāo)記（CAAX，RFP，品紅色）、肌動(dòng)蛋白（GFP，綠色）、微管蛋白（RFP，品紅色）和細(xì)胞核（組蛋白，GFP，綠色）。i) 不同時(shí)間點(diǎn)的圖像顯示最大強(qiáng)度投影（左半部分）和切片（右半部分）。
每?jī)商旄鼡Q一次培養(yǎng)基。成像使用 Viventis LS1 Live 光片顯微鏡進(jìn)行，具體設(shè)置如下：
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物鏡——25X NA1.1水鏡
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成像視野——710μm
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xy 像素大小——0.347μm
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Z軸步徑——2μm，201 步
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采集幀率為——30 分鐘
外源性細(xì)胞外基質(zhì)影響大腦類(lèi)
器官的形態(tài)發(fā)生
為了量化類(lèi)器官之間的形態(tài)動(dòng)態(tài)變化，作者利Viventis LS2光片顯微鏡低光毒性、多位點(diǎn)、多視角的成像能力，一次成像并行記錄16個(gè)類(lèi)器官通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析不同時(shí)間點(diǎn)類(lèi)器官體積、腔室體積和腔室數(shù)量，結(jié)果突出了早期大腦類(lèi)器官發(fā)育的三個(gè)形態(tài)動(dòng)力學(xué)階段，包括：
❖快速組織和腔體生長(zhǎng)的早期階段
❖涉及腔體融合事件的組織穩(wěn)定階段
❖神經(jīng)上皮成熟的最終階段
對(duì)比用基質(zhì)膠、低熔點(diǎn)瓊脂糖和不使用任何外源基質(zhì)培養(yǎng)類(lèi)器官，使用光片長(zhǎng)時(shí)間跟蹤類(lèi)器官動(dòng)力學(xué)，結(jié)果顯示外源細(xì)胞外基質(zhì)的存在對(duì)人腦類(lèi)器官的組織尺度形態(tài)發(fā)生有重大影響，且改變的組織極性可能會(huì)影響成熟神經(jīng)上皮中的細(xì)胞形態(tài)動(dòng)力學(xué)。
單細(xì)胞形態(tài)類(lèi)型分析揭示了發(fā)育中的
類(lèi)器官內(nèi)形狀的轉(zhuǎn)變
研究人員利用多位點(diǎn)標(biāo)記的質(zhì)膜、肌動(dòng)蛋白、微管、核膜和組蛋白評(píng)估細(xì)胞形態(tài)變化在早期大腦類(lèi)器官發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的影響。通過(guò)開(kāi)發(fā)的圖像分析流程：圖像預(yù)處理→亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分割→結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)→特征提取→解多通道→形態(tài)特征分析，揭示了兩個(gè)主要的核（組蛋白、層粘連蛋白）和細(xì)胞（肌動(dòng)蛋白、微管、膜）結(jié)構(gòu)組。
通過(guò)高分辨率聚類(lèi)，將結(jié)構(gòu)分組為形態(tài)類(lèi)型，即具有相似形態(tài)特征（如體積、曲率、軸長(zhǎng)的細(xì)胞簇，使用PAGA軌跡分析識(shí)別組織中的結(jié)構(gòu)變化梯度，量化了多能干細(xì)胞向早期神經(jīng)外胚層的過(guò)渡，基于細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)和組織拓?fù)渥兓纬沙墒斓纳窠?jīng)上皮。
通過(guò)對(duì)每種基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖和無(wú)外源基質(zhì)）下，對(duì)每一天成像的類(lèi)器官進(jìn)行標(biāo)記結(jié)構(gòu)的分割以及形態(tài)學(xué)分類(lèi)分析，結(jié)果表明在沒(méi)有基質(zhì)膠作為外部細(xì)胞外基質(zhì)的情況下生成的類(lèi)器官在組織拓?fù)渖习l(fā)生了變化，包含更大比例的非排列和非延長(zhǎng)細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)類(lèi)型的異質(zhì)性更高，并且未形成均勻的神經(jīng)外胚層和神經(jīng)上皮。
矩陣通過(guò)調(diào)節(jié) WNT 通路影響類(lèi)器官的
形態(tài)發(fā)生和模式形成
為了理解在不同基質(zhì)條件（基質(zhì)膠、瓊脂糖、無(wú)矩陣）下生長(zhǎng)的類(lèi)器官中發(fā)展出的分子細(xì)胞狀態(tài)，我們對(duì)第 13 天的類(lèi)器官進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，差異表達(dá)基因的基因本體分析顯示出多個(gè)信號(hào)通路的富集，包括WNT、Notch、FGF 和 Hippo 信號(hào)通路以及與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)相關(guān)的基因。
基質(zhì)膠誘導(dǎo)的神經(jīng)外胚層的強(qiáng)烈形態(tài)變化，以及在無(wú)基質(zhì)條件下 WNT 和 Hippo 信號(hào)通路的上調(diào)，測(cè)試了YAP調(diào)節(jié)對(duì)類(lèi)器官發(fā)育的影響。綜合證實(shí)了我們應(yīng)用含有外部基底膜豐富的 ECM 的 matrigel，導(dǎo)致腔體擴(kuò)張并自我模式化為主要的頭側(cè)前腦區(qū)域，并且 YAP1 的激活和 WLS 表達(dá)水平的增加促進(jìn)了發(fā)育中的神經(jīng)上皮的尾部化。
在對(duì)人類(lèi)早期腦類(lèi)器官的形態(tài)動(dòng)力學(xué)研究中，Viventis LS2 Live光片顯微鏡以極低的光毒性，通過(guò)多視角、多位置、長(zhǎng)時(shí)程的活細(xì)胞成像，展現(xiàn)腦類(lèi)器官的整個(gè)發(fā)育過(guò)程。在單次長(zhǎng)時(shí)程成像過(guò)程中，同時(shí)收集多個(gè)樣本在不同條件下的數(shù)據(jù)，結(jié)合自我開(kāi)發(fā)的分析流程、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析、信號(hào)通路探索分析，展示了YAP1 在基質(zhì)介導(dǎo)的形態(tài)發(fā)生和類(lèi)器官模式化中發(fā)揮的作用。
總的來(lái)說(shuō)，這一應(yīng)用案例為理解類(lèi)器官發(fā)育的形態(tài)動(dòng)力學(xué)提供了技術(shù)進(jìn)步，提供了對(duì)基質(zhì)介導(dǎo)的神經(jīng)上皮信號(hào)通路的機(jī)制性見(jiàn)解，并為未來(lái)探索人類(lèi)大腦發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞外微環(huán)境鋪平了道路。
參考文獻(xiàn)：
1.Method of the Year 2017: Organoids. (2018). Nature Methods
2.Elke Gabriel et.al Human brain organoids assemble functionally integrated bilateral optic vesicles Cell Stem Cell 28, 1740–1757, October 7, 2021
3.Akanksha Jain et.al Morphodynamics of human early brain organoid development bioRxiv | August 21, 2023
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