ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)操作中的各影響因素分析
ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是目前臨床上最常用的免疫學(xué)檢驗(yàn)方法，由于其試劑穩(wěn)定，易保存，操作簡便，結(jié)果判斷較客觀，既適宜于大規(guī)模篩查試驗(yàn)，又可用于少量標(biāo)本的檢測，既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析，目前已廣泛用于微生物學(xué)、寄生蟲學(xué)、腫瘤學(xué)和細(xì)胞因子檢測等領(lǐng)域。ELISA 有敏感性高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的特點(diǎn)，但其同時(shí)存在影響因素多的不足，現(xiàn)就實(shí)驗(yàn)操作中常見的影響因素進(jìn)行分析實(shí)驗(yàn)，以提高的實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。
1、樣品
樣品是檢測的前提，樣品質(zhì)量會直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？梢杂肊LISA來檢測的樣品很多，根據(jù)檢測項(xiàng)目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應(yīng)避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。
血清樣品的反復(fù)凍融會使血清中的抗體效價(jià)下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內(nèi)檢測完，可4℃保存，如需長時(shí)間檢測，可進(jìn)行分裝凍存。樣品如被細(xì)菌污染腐敗，可能會導(dǎo)致假陽性。
2、溫度
溫度主要影響抗原抗體反應(yīng)，酶促反應(yīng)速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)加速，但也易引起抗原抗體復(fù)合物的解離。酶促反應(yīng)速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學(xué)活性，降低酶的有效濃度而減慢反應(yīng)速度，溫度低時(shí)以前者為主，高時(shí)以后者為主。
溫度是質(zhì)量控制的一個(gè)重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內(nèi)溫育，微孔板不應(yīng)疊置，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，盛放微孔板的濕盒應(yīng)是金屬的，傳熱容易。空濕盒應(yīng)預(yù)先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時(shí)更需要。
3、時(shí)間
在溫度保證的前提下，時(shí)間的控制至關(guān)重要，尤其是底物顯色的時(shí)間控制，顯色時(shí)間不足或過長會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立，無法對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。
加人標(biāo)本、試劑及混合的時(shí)間稱為操作時(shí)差。操作時(shí)差在每個(gè)試驗(yàn)中都存在，對結(jié)果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項(xiàng)目，從加人第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時(shí)間差異，使抗原抗體和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。
因此，樣品過多時(shí)，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結(jié)合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時(shí)遺漏多加。
4、人員操作
ELISA成品試劑盒為檢測工作提供了方便，按照說明書進(jìn)行操作就可以完成實(shí)驗(yàn)，但人為操作時(shí)候很多細(xì)節(jié)也會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。
1）. 包被
一些ELISA反應(yīng)板需要自行進(jìn)行包被處理，沒有進(jìn)行包被，或包被液使用與檢測項(xiàng)目不同都會使實(shí)驗(yàn)失敗。包被時(shí)，未進(jìn)行震蕩，孔底未被包被液全部覆蓋會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。
2）. 反應(yīng)液稀釋
稀釋液使用錯(cuò)誤或稀釋比例不正確會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。
3）. 洗板
人工洗板時(shí)，棄去洗滌液時(shí)方法不當(dāng)，易使各孔液體相互流入，導(dǎo)致假陽性；洗滌液使用量和洗滌次數(shù)過少導(dǎo)致洗滌不徹底，洗板后未拍板或拍不干凈都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5、設(shè)備
儀器設(shè)備是ELISA實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，常用的相關(guān)儀器設(shè)備包括移液器、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)和恒溫箱等。所有設(shè)備都需要進(jìn)行檢驗(yàn)校準(zhǔn)，保證準(zhǔn)確性和精確度。
移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實(shí)驗(yàn)誤差。
酶標(biāo)儀要提前開機(jī)預(yù)熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機(jī)要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。
恒溫箱要提前開機(jī)，開、關(guān)門要快速，保證反應(yīng)溫度。
6、試劑
試劑盒要根據(jù)要求進(jìn)行保存，并保證在有效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)平衡到室溫。新購入的試劑盒要進(jìn)行校驗(yàn)，檢查實(shí)驗(yàn)是否成立，不同的試劑盒或不同批號的試劑不可混用。
7、顯色
顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng),此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。
在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延。
8、其他
封板膜封閉不嚴(yán)或開啟時(shí)孔內(nèi)液體蒸發(fā)、震出可導(dǎo)致各孔相互污染；操作時(shí)接觸到ELISA板底導(dǎo)致透光度改變，影響酶標(biāo)儀測量結(jié)果；
加樣圖省事，未認(rèn)真更換移液器吸頭，認(rèn)為其帶入標(biāo)本殘留量小，不易影響結(jié)果，是部分檢測人員常有的心理。因此加標(biāo)本時(shí)必須認(rèn)真更換移移液器吸頭，防止移液器吸頭殘留痕量產(chǎn)生假陽性結(jié)果。加樣時(shí)應(yīng)防止濺出污染其它標(biāo)本。
9、比色測定
ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，故需強(qiáng)調(diào)比色測定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。
1、樣品
樣品是檢測的前提，樣品質(zhì)量會直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果�？梢杂肊LISA來檢測的樣品很多，根據(jù)檢測項(xiàng)目不同可以是血清、血漿、唾液、尿液等，但大部分還是以血清為樣品。作為血清樣品，應(yīng)避免溶血，溶血可能會增加非特異性顯色，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)誤差。
血清樣品的反復(fù)凍融會使血清中的抗體效價(jià)下降，所以需要多次檢測的血清樣品，如在5d內(nèi)檢測完，可4℃保存，如需長時(shí)間檢測，可進(jìn)行分裝凍存。樣品如被細(xì)菌污染腐敗，可能會導(dǎo)致假陽性。
2、溫度
溫度主要影響抗原抗體反應(yīng)，酶促反應(yīng)速度及非特異性吸附，溫度升高可使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)加速，但也易引起抗原抗體復(fù)合物的解離。酶促反應(yīng)速度同樣隨溫度升高而增快，但是酶蛋白變性也加快，喪失酶學(xué)活性，降低酶的有效濃度而減慢反應(yīng)速度，溫度低時(shí)以前者為主，高時(shí)以后者為主。
溫度是質(zhì)量控制的一個(gè)重要方面，一般允許±1℃的誤差。最好水浴，微孔板浮在水面，使溫度迅速平衡。如放溫箱內(nèi)溫育，微孔板不應(yīng)疊置，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，盛放微孔板的濕盒應(yīng)是金屬的，傳熱容易。空濕盒應(yīng)預(yù)先放在溫箱中，以平衡溫度，在室溫較低時(shí)更需要。
3、時(shí)間
在溫度保證的前提下，時(shí)間的控制至關(guān)重要，尤其是底物顯色的時(shí)間控制，顯色時(shí)間不足或過長會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)不成立，無法對檢測結(jié)果進(jìn)行判斷。
加人標(biāo)本、試劑及混合的時(shí)間稱為操作時(shí)差。操作時(shí)差在每個(gè)試驗(yàn)中都存在，對結(jié)果或多或少有影響。對手工操作，尤其是樣品量大的項(xiàng)目，從加人第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本，需幾十分鐘，加人試劑及混勻存在很大的時(shí)間差異，使抗原抗體和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致，易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。
因此，樣品過多時(shí)，請選擇分批操作，對勿須更換移液口吸嘴的酶結(jié)合物，底物的加樣可選擇8聯(lián)或12聯(lián)專用的多道加液器。亦可避免單孔滴加底物時(shí)遺漏多加。
4、人員操作
ELISA成品試劑盒為檢測工作提供了方便，按照說明書進(jìn)行操作就可以完成實(shí)驗(yàn)，但人為操作時(shí)候很多細(xì)節(jié)也會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差。
1）. 包被
一些ELISA反應(yīng)板需要自行進(jìn)行包被處理，沒有進(jìn)行包被，或包被液使用與檢測項(xiàng)目不同都會使實(shí)驗(yàn)失敗。包被時(shí)，未進(jìn)行震蕩，孔底未被包被液全部覆蓋會導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差。
2）. 反應(yīng)液稀釋
稀釋液使用錯(cuò)誤或稀釋比例不正確會導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或結(jié)果不準(zhǔn)確。
3）. 洗板
人工洗板時(shí)，棄去洗滌液時(shí)方法不當(dāng)，易使各孔液體相互流入，導(dǎo)致假陽性；洗滌液使用量和洗滌次數(shù)過少導(dǎo)致洗滌不徹底，洗板后未拍板或拍不干凈都會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
5、設(shè)備
儀器設(shè)備是ELISA實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)，常用的相關(guān)儀器設(shè)備包括移液器、酶標(biāo)儀、洗板機(jī)和恒溫箱等。所有設(shè)備都需要進(jìn)行檢驗(yàn)校準(zhǔn)，保證準(zhǔn)確性和精確度。
移液器的使用要盡可能選擇所需加液量接近最大量程，并正確使用，減少實(shí)驗(yàn)誤差。
酶標(biāo)儀要提前開機(jī)預(yù)熱，保證光源穩(wěn)定；洗板機(jī)要檢查加液孔是否通暢，保證加液量。
恒溫箱要提前開機(jī)，開、關(guān)門要快速，保證反應(yīng)溫度。
6、試劑
試劑盒要根據(jù)要求進(jìn)行保存，并保證在有效期內(nèi)使用，使用前應(yīng)平衡到室溫。新購入的試劑盒要進(jìn)行校驗(yàn)，檢查實(shí)驗(yàn)是否成立，不同的試劑盒或不同批號的試劑不可混用。
7、顯色
顯色是ELISA中的最后一步反應(yīng),此時(shí)酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時(shí)間的延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。
在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進(jìn)行,時(shí)間一般不需要嚴(yán)格控制,有時(shí)可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延。
8、其他
封板膜封閉不嚴(yán)或開啟時(shí)孔內(nèi)液體蒸發(fā)、震出可導(dǎo)致各孔相互污染；操作時(shí)接觸到ELISA板底導(dǎo)致透光度改變，影響酶標(biāo)儀測量結(jié)果；
加樣圖省事，未認(rèn)真更換移液器吸頭，認(rèn)為其帶入標(biāo)本殘留量小，不易影響結(jié)果，是部分檢測人員常有的心理。因此加標(biāo)本時(shí)必須認(rèn)真更換移移液器吸頭，防止移液器吸頭殘留痕量產(chǎn)生假陽性結(jié)果。加樣時(shí)應(yīng)防止濺出污染其它標(biāo)本。
9、比色測定
ELISA的比色測定由酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，故需強(qiáng)調(diào)比色測定時(shí)，一定要注意酶標(biāo)儀的波長是否是雙波長（450nm和630nm）。
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