客戶聲音：全光譜激光共聚焦成像系統(tǒng)，實時熒光壽命成像不二之選

瀏覽次數(shù)：270　發(fā)布日期：2024-10-21　來源：徠卡顯微鏡

本文轉(zhuǎn)載自浙大實驗設(shè)備處公眾號

編者說
大型科研儀器是科研實現(xiàn)原創(chuàng)性突破的利器，開放共享開辟了科技創(chuàng)新的新賽道。為促使我校大型儀器共享與服務(wù)水平上一個新的臺階，讓“器”的投入最終在“智”上顯出更廣更大的效應(yīng)和價值，實驗室與設(shè)備管理處微信公眾號將陸續(xù)推出“大儀說”系列報道，旨在幫助校內(nèi)外用戶深入了解學(xué)校大型科研儀器設(shè)備，促進(jìn)共享與合作。

大儀速寫
傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡以單譜線激光器作為光源，利用不同熒光探針標(biāo)記生物樣本內(nèi)不同組分，分析熒光強(qiáng)度參數(shù)實現(xiàn)較高的成像對比度和特異性，但檢測結(jié)果易受熒光團(tuán)濃度、激發(fā)光強(qiáng)度、光漂白等因素影響。熒光壽命成像技術(shù)（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）不受激發(fā)光強(qiáng)度、熒光團(tuán)濃度、光漂白等因素影響。熒光壽命與熒光團(tuán)所處的微環(huán)境密切相關(guān)，能反映微環(huán)境中pH、折射率、離子濃度等變化，是熒光團(tuán)的固有屬性。通過測量熒光壽命可精準(zhǔn)定量不同樣本或?qū)崟r分析處于不同狀態(tài)的生物樣品，獲得與熒光光譜技術(shù)、熒光強(qiáng)度檢測技術(shù)互補的結(jié)構(gòu)與功能信息。熒光壽命測量系統(tǒng)基于激光掃描共聚焦顯微系統(tǒng)（LSCM）的搭建，熒光壽命成像變得高效且簡單。

圖1. 小鼠胚胎的熒光壽命圖像

圖示短壽命藍(lán)色，中等壽命黃色，長壽命為橙色和紅色。722個視野拼接，擬合出4個獨立的特征壽命，采集時間約1小時，傳統(tǒng)方法約1天。

與傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡相比，全光譜激光共聚焦激發(fā)端可在440-790nm波段內(nèi)任意調(diào)節(jié)，檢測端可在410-850 nm內(nèi)接收熒光信號，激發(fā)光和熒光得到精準(zhǔn)最高效的利用，實現(xiàn)了對目前市面上多數(shù)近紅外染料標(biāo)記成像的需求。因其激發(fā)與發(fā)射光譜的自由設(shè)置，染料可自由選擇，輕松實現(xiàn)特殊染料成像、多色成像、光譜近似的染料成像區(qū)分、目標(biāo)標(biāo)記和自發(fā)熒光成像區(qū)分等多種普通共聚焦無法實現(xiàn)的高端實驗。

圖2.多色熒光成像（7色）

圖示由醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺組織形態(tài)學(xué)分平臺提供的多標(biāo)記腫瘤組織，七色成像，精準(zhǔn)獲得不同標(biāo)記的位置和形態(tài)信息。

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺引進(jìn)的全新全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)（Stellaris 8 Falcon），一改傳統(tǒng)共聚焦固定譜線的激光激發(fā)成像模式，基于靈活設(shè)置的激發(fā)端和高靈敏的檢測端，不僅實現(xiàn)了高分辨率的快速共聚焦多色成像、近遠(yuǎn)紅染料成像等，更是理想的壽命成像和分析設(shè)備，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有較大的應(yīng)用潛力。

圖3. 全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)（Stellaris 8 Falcon）

大儀零距離
該設(shè)備的工作原理是什么？

該設(shè)備基于倒置激光共聚焦顯微鏡，集成了全光譜連續(xù)可調(diào)脈沖激光器激發(fā)系統(tǒng)，搭載精準(zhǔn)光子計數(shù)模式高靈敏混合探測器（HyD），不僅可實現(xiàn)強(qiáng)度成像，也讓熒光壽命成像變得高效且簡單。

熒光壽命是指分子停留在激發(fā)態(tài)的平均時間ns。通過觀察足夠大量的激發(fā)-發(fā)射事件集合來測量熒光染料的典型壽命。測量圖像中所有像素平均光子到達(dá)時間，即熒光壽命成像(FLIM）。熒光壽命范圍一般在0.2-20ns之間，反映了熒光分子內(nèi)在屬性和所處微環(huán)境。

圖4. 熒光壽命成像原理

在功能上有什么獨特性和先進(jìn)性？

1）熒光強(qiáng)度測量。配備自由連續(xù)可調(diào)脈沖白激光器，擁有351根激發(fā)譜線，可同時分離8根激光譜線；加上超高靈敏度熒光檢測范圍達(dá)850 nm的檢測器。自由選擇染料并同時8色成像，輕松實現(xiàn)一些特殊染料或近紅外染料的快速成像。

2）熒光壽命測量。實現(xiàn)視頻速率的快速熒光壽命成像，可用于監(jiān)測代謝狀態(tài)和微環(huán)境變化、分子間快速相互作用(FLIM-FRET)、膜張力研究（Flipper-TR）、不同壽命組分高效拆分等。

熒光壽命檢測模塊和共聚焦的整合，既能做最基礎(chǔ)的單光子共聚焦成像，又能實現(xiàn)高分辨的高精度特殊多色成像。可在亞細(xì)胞水平上檢測Ca²⁺、pH值、膜電位等生理信號及細(xì)胞形態(tài)的變化。同時具備FLIM熒光壽命成像功能支持多種應(yīng)用。

該設(shè)備為科學(xué)研究帶來哪些新應(yīng)用？

該設(shè)備是目前功能極為全面的全光譜激光共聚焦成像系統(tǒng)。具備FLIM熒光壽命成像模塊、Lightning高分辨成像模塊、共聚焦常規(guī)模塊（3D、時間、多點、光譜掃描、大視野拼圖）和活細(xì)胞孵育系統(tǒng)，除了完成細(xì)胞或組織內(nèi)熒光信號的檢測外，還可開展FLIM熒光壽命成像，F(xiàn)LIM-FRET、組分分析分離、局部離子濃度、微環(huán)境(如pH值)、區(qū)分光譜近似的染料、區(qū)分染料和自發(fā)熒光等多種普通共聚焦無法實現(xiàn)的高端實驗。

在傳統(tǒng)熒光強(qiáng)度和熒光光譜兩個維度的基礎(chǔ)上，又增加了熒光壽命這一新的成像維度，大大拓展了該系統(tǒng)在細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等眾多學(xué)科中的應(yīng)用。

目前有哪些應(yīng)用案例?
在功能成像領(lǐng)域中，監(jiān)測小分子、離子或電勢的動態(tài)變化，通常是用熒光探針來完成，其中多數(shù)顯示出強(qiáng)度和壽命的變化。也可以用熒光蛋白裝飾蛋白質(zhì)，并在活細(xì)胞中表達(dá)這些構(gòu)建體。最為現(xiàn)代化的工具是蛋白質(zhì)或肽，它們與所需的分析物（如Ca²⁺）結(jié)合，并裝飾有一對進(jìn)行FRET的熒光蛋白。結(jié)合分析物后，肽發(fā)生構(gòu)象變化，F(xiàn)RET將出現(xiàn)或消失。這些探針被稱為FRET-生物傳感器。生物傳感器的一種是利用cAMP結(jié)合蛋白Epac。

圖5. FRET跟蹤活細(xì)胞中的分子相互作用

圖示用游離態(tài)的cAMP刺激培養(yǎng)細(xì)胞，并用Epac FRET-生物傳感器進(jìn)行監(jiān)測。在紅色圓圈區(qū)域分析信號（平均到達(dá)時間tₐ）。隨時間變化的圖示見底部。由K.Jalink，B.van den Broek，NKI Amsterdam(NL)提供。

FALCON的計數(shù)速度足夠快，可在活細(xì)胞中使用化學(xué)傳感器和FRET生物傳感器進(jìn)行熒光壽命成像。無染色應(yīng)用是分析活體材料中的內(nèi)源性熒光。例如：癌細(xì)胞抑制細(xì)胞呼吸，傾向于無氧糖酵解（瓦博格效應(yīng)），這會導(dǎo)致積累更高濃度的熒光NADH。即使沒有活檢，多光子顯微鏡也能在皮膚組織中進(jìn)行深度成像。同樣，壽命對比度要可靠得多，因為深層的顯微鏡會受到吸收和陰影效應(yīng)的影響，從而使強(qiáng)度信號失真。

傳統(tǒng)意義上，不同的熒光染料以其不同的顏色來區(qū)分。如果激發(fā)和發(fā)射相同，仍可通過壽命進(jìn)行區(qū)分。發(fā)射強(qiáng)度和壽命可以作為顏色的函數(shù)獨立記錄。因此，可見熒光染料的數(shù)量是發(fā)射光譜和擬合壽命的乘積。

圖6. lt-染料分離的原理證據(jù)（6個信號）

圖示用480 nm激發(fā)云杉葉的新鮮切片，在兩個通道（頂部和底部行）中進(jìn)行記錄，每個通道可分開顯示三個壽命（從左到右）。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。

這臺設(shè)備開放共享情況如何？可以通過什么途徑聯(lián)系使用它？

全光譜高分辨激光共聚焦成像系統(tǒng)自2023年6月引進(jìn)正式投入使用以來，已服務(wù)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院、藥學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院、農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院、化學(xué)工程與生物工程學(xué)院、附屬醫(yī)院等校內(nèi)外多家單位，累計機(jī)時近兩千小時，培訓(xùn)師生近百人。未來，我們希望繼續(xù)提高設(shè)備利用率，加強(qiáng)開放共享，更好的服務(wù)廣大科研用戶，期待與更多單位開展合作研究。

如果需要使用這臺儀器，可登入浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共技術(shù)平臺網(wǎng)站或聯(lián)系楊老師進(jìn)行預(yù)約。

醫(yī)學(xué)院公共平臺網(wǎng)址：

https://www.cfzsm.zju.edu.cn

聯(lián)系方式：

楊老師 0919304@zju.edu.cn

0571-88206765