隨著生物醫(yī)學(xué)研究對(duì)復(fù)雜組織結(jié)構(gòu)和功能的深入探索，高分辨率、高信噪比的深組織成像技術(shù)變得愈加重要。傳統(tǒng)的顯微鏡技術(shù)往往局限于二維、透明的生物薄樣本的觀測(cè)，這在很大程度上無(wú)法滿足當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)θ�維深組織體成像的研究需求。

光片熒光顯微鏡憑借其低光損傷、高采集速率、大視場(chǎng)、體成像等優(yōu)點(diǎn)被生物學(xué)家廣泛使用。然而，生物組織固有的高散射特性仍然為深層成像帶來(lái)了巨大的挑戰(zhàn)。

南京理工大學(xué)周笑團(tuán)隊(duì)在《激光與光電子學(xué)進(jìn)展》發(fā)表文章，重點(diǎn)介紹了光片熒光顯微成像技術(shù)在深組織成像領(lǐng)域的最新進(jìn)展，特別是應(yīng)對(duì)高散射樣本挑戰(zhàn)的解決策略，旨在為相關(guān)領(lǐng)域的研究人員提供有價(jià)值的參考，助力其對(duì)該前沿技術(shù)的最新進(jìn)展和應(yīng)用前景的理解。

光片熒光顯微鏡的基本原理與挑戰(zhàn)
1.基本原理
成像方式獨(dú)特：光片熒光顯微鏡采用照明與探測(cè)正交的方式進(jìn)行三維圖像采集。激光從一側(cè)對(duì)樣品照明激發(fā)，在與照明光路垂直的方向探測(cè)熒光。這種方式與傳統(tǒng)熒光顯微成像技術(shù)相比，只激發(fā)焦點(diǎn)處的熒光，有效減少了離焦熒光信號(hào)的干擾，從而降低了光漂白與光毒性，同時(shí)也減少了背景噪聲，極大地提升了成像質(zhì)量。

光片形成及影響因素：

• 照明光路：主要用于光片的形成，其厚度決定了系統(tǒng)的光學(xué)切片能力。常見的光片形成方法有柱面透鏡聚焦形成靜態(tài)高斯光片和使用掃描振鏡在物鏡焦平面快速移動(dòng)聚焦光束形成動(dòng)態(tài)的虛擬光片（如數(shù)字掃描光片顯微鏡DLSM）。靜態(tài)高斯光片厚度一般為幾微米到十幾微米，提供低光毒性照明但軸向分辨率受制約，成像速度慢且可能不均勻照明，對(duì)厚樣品成像深度有限；動(dòng)態(tài)光片將照明能量集中在單線上，可實(shí)現(xiàn)更均勻照明，光片厚度可達(dá)亞微米級(jí)別，獲得更高軸向分辨率，受散射影響小，成像質(zhì)量高且速度快。
• 探測(cè)光路：決定了系統(tǒng)橫向分辨率，并與光片厚度共同影響系統(tǒng)的軸向分辨率。

高散射樣本成像質(zhì)量問題：在觀測(cè)如大腦或心臟的厚層切片和腫瘤組織等高散射生物樣本時(shí)，樣本內(nèi)部復(fù)雜結(jié)構(gòu)和光學(xué)異質(zhì)性導(dǎo)致光片在樣品內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的散射與吸收，進(jìn)而引起圖像模糊或失真。光片熒光顯微鏡從側(cè)面一次照亮整個(gè)平面的照明方式，還會(huì)使采集的數(shù)據(jù)中存在條紋偽影，降低圖像質(zhì)量，同時(shí)散射會(huì)減弱焦點(diǎn)處熒光信號(hào)，降低圖像對(duì)比度。

主要技術(shù)進(jìn)展
1.激發(fā)光調(diào)制
無(wú)衍射光束應(yīng)用：研究人員采用貝塞爾光束以及其他無(wú)衍射光束代替高斯光束。貝塞爾光束在傳播過(guò)程中能保持較小束腰尺寸，且具備“自我修復(fù)”特性，即使在高散射介質(zhì)中也能保持較長(zhǎng)的均勻光片，有效減少對(duì)組織內(nèi)部成像時(shí)的畸變。

例如Planchon等采用掃描貝塞爾光束形成比高斯光束有效長(zhǎng)度長(zhǎng)3-5倍的光片。艾里光束能產(chǎn)生比相同數(shù)值孔徑的高斯或貝塞爾光束更薄的光片，雖然其不對(duì)稱激發(fā)模式可能導(dǎo)致圖像略顯模糊或扭曲，但通過(guò)反卷積算法處理可恢復(fù)細(xì)節(jié)。華中科技大學(xué)團(tuán)隊(duì)提出的雙環(huán)調(diào)制選擇平面照明顯微鏡（IDDR-SPIM）和中國(guó)科學(xué)院西安光機(jī)所團(tuán)隊(duì)提出的互補(bǔ)光束相減光片熒光顯微成像技術(shù)（CBS-LSFM）等進(jìn)一步優(yōu)化了貝塞爾光束的應(yīng)用，減少了圖像偽影，提高了軸向分辨率與信噪比。

近紅外激發(fā)光優(yōu)勢(shì)：較長(zhǎng)波長(zhǎng)的近紅外光具有更長(zhǎng)的散射平均自由程，在生物組織中傳播時(shí)更不容易被介質(zhì)中的小顆粒散射，從而實(shí)現(xiàn)更深的組織穿透。

例如Wang等利用近紅外二區(qū)光片顯微鏡對(duì)小鼠腦組織成像，1320nm激發(fā)光能夠在甘油清除的腦組織中進(jìn)行較深和較寬的光學(xué)切片成像。目前已開發(fā)多種在近紅外二區(qū)發(fā)射的熒光探針，促進(jìn)了其在心血管疾病、腦部病變和癌癥小鼠模型成像中的應(yīng)用，但開發(fā)適用于該光學(xué)窗口的探針仍具挑戰(zhàn)性。

2.多視圖融合
多角度信息獲取及融合：多視圖融合技術(shù)通過(guò)同時(shí)獲取樣本不同視角或不同光路的成像信息，并利用融合算法對(duì)樣本進(jìn)行三維重建，有效降低了散射的影響，提高了深組織成像的質(zhì)量。

不同方法及應(yīng)用案例：最原始的方法是旋轉(zhuǎn)樣本并從不同角度采集圖像，如Huisken等采用該方法實(shí)現(xiàn)了基因和蛋白質(zhì)表達(dá)模式的高分辨率三維可視化。Ahrens等使用雙物鏡激發(fā)系統(tǒng)提供更均勻的照明平面，有效去除偽影，其軸向分辨率比單向選擇平面照明顯微鏡提高了2倍，且成像速度更快。

華中科技大學(xué)龔輝教授團(tuán)隊(duì)利用雙光束照明和共焦雙縫檢測(cè)提高圖像信噪比和質(zhì)量。為解決順序多視圖成像的時(shí)空偽影問題，研究人員開發(fā)了同步多視圖選擇平面照明顯微鏡（SiMView-SPIM）等技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)幾乎完整的樣本覆蓋，成像速度大幅提高，還有其他如各向同性選擇平面照明顯微鏡（IsoView SPIM）、多視圖選擇平面照明顯微鏡（MuViSPIM）和四透鏡光片顯微鏡等技術(shù)也在一定程度上優(yōu)化了系統(tǒng)參數(shù)，應(yīng)用于胚胎發(fā)育等多個(gè)研究領(lǐng)域。

3.非線性光學(xué)
非線性光學(xué)效應(yīng)原理及應(yīng)用：非線性光學(xué)效應(yīng)是在高光強(qiáng)條件下光與物質(zhì)相互作用出現(xiàn)的非線性響應(yīng)，如雙光子吸收（2PA）、二次諧波發(fā)生（SHG）和相干反斯托克斯拉曼散射（CARS），其中雙光子吸收在生物成像中應(yīng)用最廣泛。雙光子顯微鏡基于雙光子吸收效應(yīng)構(gòu)建，其發(fā)光原理是“同時(shí)”吸收兩個(gè)光子形成一個(gè)分子進(jìn)入激發(fā)態(tài)，再回到基態(tài)釋放出熒光。這種非線性激發(fā)只激發(fā)焦點(diǎn)處熒光，顯著減弱了光的散射和吸收，相比于傳統(tǒng)的單光子寬場(chǎng)熒光顯微鏡，能夠?qū)崿F(xiàn)更深的組織穿透和更精準(zhǔn)的光學(xué)切片，通常采用紅外激發(fā)進(jìn)一步增強(qiáng)組織穿透能力。

4.波前校正
自適應(yīng)光學(xué)原理及應(yīng)用：自適應(yīng)光學(xué)最初用于天文望遠(yuǎn)鏡，其核心原理是利用動(dòng)態(tài)元件如可變形鏡或空間光調(diào)制器進(jìn)行波前控制，校正成像系統(tǒng)產(chǎn)生的相位畸變，減少系統(tǒng)由光學(xué)元件及樣品本身引起的像差，從而優(yōu)化成像系統(tǒng)的性能。波前的校正可通過(guò)直接波前傳感技術(shù)或迭代的無(wú)傳感器方法實(shí)現(xiàn)。

在光學(xué)顯微鏡中，自適應(yīng)光學(xué)已成為校正像差和恢復(fù)衍射極限分辨率的重要工具。應(yīng)用于光片顯微鏡方面，Bourgenot等采用無(wú)波前傳感器的方法，在探測(cè)光路中加入可變形鏡對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚成像，極大提高了成像質(zhì)量，特別是成像深度。Royer等提出基于AutoPilot框架的時(shí)空自適應(yīng)成像方法，可從多個(gè)角度捕捉高分辨率生物樣本圖像，提高空間分辨率和信號(hào)強(qiáng)度。還有其他研究將晶格光片顯微鏡與自適應(yīng)光學(xué)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞過(guò)程的無(wú)像差成像。

5.樣品處理
早期嘗試及局限：在生物學(xué)成像領(lǐng)域，早期研究人員嘗試通過(guò)調(diào)整物鏡浸沒介質(zhì)的折射率來(lái)降低組織的散射，以增強(qiáng)光片的穿透能力，但這種方法在提高樣品透明度和穿透能力方面效果有限。

針對(duì)組織透明化過(guò)程中可能對(duì)某些蛋白質(zhì)或結(jié)構(gòu)造成破壞的問題，研究人員進(jìn)一步開發(fā)了組織膨脹技術(shù)，該技術(shù)可在保持組織結(jié)構(gòu)的同時(shí)均勻地將樣品物理放大，使原本低于光學(xué)顯微鏡分辨率的細(xì)節(jié)特征能夠可視化。例如Gao等將膨脹顯微鏡與超分辨率晶格光片顯微鏡結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了小鼠和果蠅大腦的近納米級(jí)成像，西湖大學(xué)高亮教授團(tuán)隊(duì)提出的多功能平鋪光片顯微鏡通過(guò)組織膨脹處理提高了分辨率。

深組織光片熒光顯微成像應(yīng)用
1.發(fā)育生物學(xué)
實(shí)時(shí)活體成像優(yōu)勢(shì)：光片熒光顯微鏡因其低光毒性和光損傷特性，成為實(shí)時(shí)活體樣本成像的理想選擇，最初主要應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)領(lǐng)域。

應(yīng)用案例及成果：Keller等利用數(shù)字掃描光片顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育初期細(xì)胞核定位和運(yùn)動(dòng)的亞細(xì)胞分辨率成像；Chhetri等開發(fā)的各向同性多視圖光片熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)了對(duì)果蠅原腸受精胚胎發(fā)育過(guò)程的多視圖反卷積成像；McDole等開發(fā)的自適應(yīng)成像框架可對(duì)小鼠胚胎從原腸胚形成到早期器官發(fā)育的過(guò)程進(jìn)行成像；Daetwyler等同時(shí)對(duì)多個(gè)斑馬魚胚胎樣品進(jìn)行成像，為定量研究生物過(guò)程提供了基礎(chǔ)。這些方法有助于研究人員深入觀察胚胎發(fā)育及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)展等復(fù)雜生物過(guò)程。

應(yīng)用案例及成果：Ahrens等開發(fā)的同步多視圖光片顯微鏡記錄了斑馬魚大腦中幾乎所有神經(jīng)元單細(xì)胞分辨率成像；Xiao等采用晶格光片顯微鏡研究斑馬魚神經(jīng)損傷模型中細(xì)胞間的相互作用；Pan等開發(fā)的組織透明化溶液使器官和動(dòng)物身體透明，結(jié)合光片顯微鏡對(duì)神經(jīng)和血管系統(tǒng)成像，可觀察單個(gè)神經(jīng)元和突觸的結(jié)構(gòu)；de Medeiros等采用四物鏡光片顯微鏡結(jié)合短紅外激光脈沖實(shí)現(xiàn)了對(duì)斑馬魚亞細(xì)胞水平的神經(jīng)元成像。這些研究有助于深入了解神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，以及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)神經(jīng)活動(dòng)。

3.組織病理學(xué)
活體組織檢查優(yōu)勢(shì)：光片顯微鏡提供了一種快速、無(wú)需切片、低光漂白、非破壞性的活體組織檢查方法，吸引了臨床病理學(xué)家的廣泛關(guān)注。

應(yīng)用案例及成果：Glaser等開發(fā)的非破壞性開放式光片顯微鏡可實(shí)現(xiàn)橫向無(wú)約束成像，用于術(shù)中對(duì)新鮮人類前列腺組織和乳腺組織的病理成像；Migliori等開發(fā)的光片θ顯微鏡從檢測(cè)物鏡同一側(cè)均勻照亮樣品，對(duì)人腦厚冠狀板進(jìn)行快速高分辨率定量成像；Glaser等進(jìn)一步開發(fā)的多浸入的開放式光片顯微鏡可對(duì)組織透明化的標(biāo)本進(jìn)行便捷的高通量成像。光片熒光顯微成像技術(shù)可幫助病理學(xué)家更好地了解組織的生長(zhǎng)和形態(tài)變化，提高診斷疾病和分期病變的能力。

結(jié)論與展望
光片熒光顯微成像技術(shù)憑借其獨(dú)特的照明和探測(cè)方式，具備低光損傷、高分辨率和快速三維體成像等特性，優(yōu)化了傳統(tǒng)顯微成像效果，成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要工具。

面對(duì)生物樣本的多樣性與復(fù)雜性帶來(lái)的光散射與組織穿透能力的局限，研究人員通過(guò)多種技術(shù)優(yōu)化突破了這一難題，使其在深組織成像領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

該技術(shù)不僅能揭示單個(gè)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，還能深入到細(xì)胞群體中觀察互動(dòng)和通訊，為理解復(fù)雜生物過(guò)程提供新視角，預(yù)示著更多科研突破和醫(yī)學(xué)應(yīng)用的可能性。

聲明：本文僅用作學(xué)術(shù)目的。文章來(lái)源于:周笑, 左超, 劉永燾. 深組織光片熒光顯微成像研究進(jìn)展（特邀）[J]. 激光與光電子學(xué)進(jìn)展, 2024, 61(2): 0211010. Xiao Zhou, Chao Zuo, Yongtao Liu. Advances in Deep-Tissue Light-Sheet Fluorescence Microscopic Imaging (Invited)[J]. Laser & Optoelectronics Progress, 2024, 61(2): 0211010.