在分子互作研究的復(fù)雜世界中，獲得更精確數(shù)據(jù)不僅是目標(biāo)——而是必需。作為研究人員，您可能會(huì)遇到一些棘手問題：例如，我的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是否是真實(shí)的生物條件反映？是否有我未能察覺到的關(guān)鍵信息？我該如何檢測(cè)微弱的分子相互作用？等等。

在這種情況下，如果有一種技術(shù)可以保持樣本原生條件，可提供多個(gè)正交、互補(bǔ)的解析維度，而且最關(guān)鍵的是同時(shí)同步獲取多維讀數(shù)的技術(shù)就顯得尤為重要。層流誘導(dǎo)分散分析（FIDA）就是這樣一種技術(shù)。

FIDA可通過三個(gè)維度的生物物理參數(shù)對(duì)分子互作進(jìn)行分析——分別是第一性原理的Rh（水動(dòng)力學(xué)半徑），BRIC（結(jié)合依賴的熒光強(qiáng)度變化）和LD（Lambda Dynamics，光譜位移）。

• R_h（水動(dòng)力學(xué)半徑）反應(yīng)分子在溶液中的粒徑大小，F(xiàn)IDA通過第一性原理能夠獲得極其精確的絕對(duì)數(shù)值，分辨率低至1%的粒徑變化追蹤。分子粒徑是衡量分子結(jié)構(gòu)最為重要的參數(shù)之一，F(xiàn)IDA對(duì)粒徑表征的高分辨率對(duì)于準(zhǔn)確表征分子復(fù)合物至關(guān)重要。

• BRIC（結(jié)合依賴的熒光強(qiáng)度變化）作為一種基于熒光的讀數(shù)，BRIC敏感地反應(yīng)結(jié)合引起的分子構(gòu)象變化，構(gòu)象變化作為分子結(jié)構(gòu)完整性的補(bǔ)充（粒徑變化），BRIC顯得尤為重要。

• LD(Lambda Dynamics，光譜位移）指的是當(dāng)結(jié)合事件改變熒光團(tuán)或其他光學(xué)標(biāo)記微環(huán)境時(shí)，檢測(cè)信號(hào)的波譜（lambda）發(fā)生的變化。這些變化為分子結(jié)合提供了額外的見解，提升了蛋白與小分子互作分析的解析度。

技術(shù)通過光譜位移（LD，Lambda Dynamics）、結(jié)合依賴的熒光強(qiáng)度變化（BRIC）和水動(dòng)力學(xué)半徑測(cè)量（R_h），為解析分子相互作用提供了獨(dú)特的多維視角。這種整合提升了靈敏度和準(zhǔn)確性，使得研究人員能夠在原生條件下檢測(cè)微小的分子變化和結(jié)合動(dòng)力學(xué)，同時(shí)有效處理復(fù)雜樣品。這種綜合能力使FIDA在藥物開發(fā)和生物標(biāo)志物驗(yàn)證等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。

下面將詳細(xì)介紹下BRIC（結(jié)合依賴的熒光強(qiáng)度變化）和LD（光譜位移）是如何捕捉更微弱的分子相互作用的。

BRIC（結(jié)合依賴的熒光強(qiáng)度變化）
什么是BRIC?
BRIC代表與結(jié)合依賴的熒光強(qiáng)度變化，是FIDA技術(shù)的一個(gè)重要方面。它測(cè)量當(dāng)分子（如蛋白質(zhì)或小配體）相互結(jié)合，或由于環(huán)境變化導(dǎo)致蛋白質(zhì)改變其構(gòu)象狀態(tài)時(shí)熒光強(qiáng)度的變化。

BRIC測(cè)量可視化
峰面積 = 強(qiáng)度（總熒光）

BRIC讀數(shù)提供了關(guān)于結(jié)合事件的信息，這些事件在復(fù)雜的生物環(huán)境中（如血清或細(xì)胞裂解液）可被靈敏的追蹤。對(duì)于用戶而言，BRIC與Rh可通過一次實(shí)驗(yàn)同時(shí)獲得，后者提供了分子大小的絕對(duì)測(cè)量。擁有這兩種正交讀數(shù)使研究人員能夠更全面、多維地理解分子相互作用。

淬滅效應(yīng)與BRIC
熒光淬滅是指由于各種因素（如分子碰撞、能量轉(zhuǎn)移或局部環(huán)境變化）導(dǎo)致分子（熒光團(tuán)）的熒光減少的過程。當(dāng)發(fā)生分子變化（如結(jié)合事件）時(shí)，例如配體結(jié)合到蛋白質(zhì)上，它可以使熒光團(tuán)靠近淬滅劑，或改變熒光基團(tuán)周圍的微環(huán)境，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的變化。

BRIC利用這些熒光強(qiáng)度的變化來檢測(cè)和量化結(jié)合相互作用。具體而言：

• 環(huán)境變化：分子結(jié)合通常改變熒光基團(tuán)周邊的極性、pH或其他特性，這可能增強(qiáng)或減弱熒光。BRIC測(cè)量這些強(qiáng)度變化，提供有關(guān)結(jié)合動(dòng)態(tài)和分子相互作用的見解。

• 靜態(tài)淬滅：當(dāng)結(jié)合事件導(dǎo)致熒光團(tuán)和淬滅劑之間形成非熒光復(fù)合物時(shí)，熒光強(qiáng)度會(huì)下降。BRIC可以通過測(cè)量這種強(qiáng)度的降低來指示結(jié)合的發(fā)生。

總之，淬滅效應(yīng)是BRIC檢測(cè)分子變化（例如結(jié)合事件）的基本方面。通過監(jiān)測(cè)由于淬滅引起的熒光強(qiáng)度的減少（或增加），BRIC為研究分子相互作用的發(fā)生、強(qiáng)度和性質(zhì)提供了寶貴的數(shù)據(jù)。這使BRIC成為在各種研究和藥物開發(fā)背景下研究生物分子相互作用的敏感工具。
 

在原生溶液條件中測(cè)量BRIC優(yōu)勢(shì)
首先，BRIC信號(hào)測(cè)量不需要溫度變化（其他技術(shù)中使用溫度變化來誘導(dǎo)熒光變化）。重要的是要注意，熒光強(qiáng)度在變化條件下測(cè)量的技術(shù)中，例如涉及熱的技術(shù)，讀數(shù)可能會(huì)變得不可靠甚至無效，因?yàn)闃颖镜臓顟B(tài)發(fā)生了變化。由于在FIDA中溫度保持恒定，因此不會(huì)出現(xiàn)這種情況，條件保持原生。

其次，BRIC信號(hào)讀值會(huì)自動(dòng)調(diào)整以考慮基質(zhì)復(fù)雜性。也就是說，感興趣的信號(hào)被提取并從背景信號(hào)中分離，使得在復(fù)雜基質(zhì)中容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

因此，從實(shí)際角度看，使用BRIC技術(shù)具有幾個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)：

• 保持原生條件：BRIC允許在生理?xiàng)l件下研究生物分子相互作用，在和小分子互作研究中可測(cè)量無標(biāo)記蛋白質(zhì)的BRIC變化，而不必因溫度變化而破壞或改變分子的原生結(jié)構(gòu)，從而提供更準(zhǔn)確和可靠的數(shù)據(jù)。

• 與復(fù)雜介質(zhì)的兼容性：BRIC在恒溫下測(cè)量相互作用，且考慮背景噪音的干擾，使BRIC在分析復(fù)雜介質(zhì)（如血液或血清）樣本時(shí)尤其具有價(jià)值，在這些介質(zhì)中，溫度變化可能會(huì)妨礙樣本的完整性，而這些樣本又具有高度的復(fù)雜性。（FIDA技術(shù)通常與復(fù)雜介質(zhì)和各種緩沖液高度兼容。）

Lambda Dynamics（光譜位移）
什么是Lambda Dynamics？
LD（Lambda Dynamic）的核心在于捕捉分子在溶液中相互作用時(shí)發(fā)生的微小發(fā)射光譜變化。波長位移變化數(shù)據(jù)攜帶著有關(guān)相互作用動(dòng)態(tài)的寶貴信息。更具體地說，光譜位移是指在結(jié)合事件改變熒光基團(tuán)微環(huán)境時(shí)，檢測(cè)到的熒光信號(hào)波長（lambda）的位移變化。這些位移提供了關(guān)于結(jié)合相互作用的見解，并可能指示參與結(jié)合分子的構(gòu)象、取向或接近度的變化。LD利用了被稱為“lambda比率測(cè)量”的原理（Alexander Damchenko，2010&2014）。正如Damchenko所指出的，LD在研究分子間相互作用時(shí)特別有價(jià)值，因?yàn)樗�提供了比單波長測(cè)量更可靠和詳細(xì)的讀數(shù)。

在實(shí)際操作中，LD采用了波長比率測(cè)量的核心理念，并應(yīng)用于增強(qiáng)生物分子相互作用研究的深度和可靠性。獨(dú)特的背景扣除模式結(jié)合專有的FIDA技術(shù)，使得親和力Kd和溶液動(dòng)力學(xué)Kon/Koff的準(zhǔn)確性都提升到現(xiàn)有互作技術(shù)無法達(dá)到的水平。
 

FIDA LD與其他方法的比較

我們將FIDA LD與不同測(cè)量方法獲得的親和力常數(shù)（Kd）比較。Fida LD中的每個(gè)結(jié)合曲線點(diǎn)均以三次重復(fù)進(jìn)行測(cè)量（其它技術(shù)由于本身限制無法提供連續(xù)三次技術(shù)重復(fù)）。

本次比較的親和力常數(shù)（Kd）是對(duì)應(yīng)于酶碳酸酐酶與三種小分子抑制劑之間的相互作用。使用Fida Neo儀器獲得的Fida LD的Kd值與其他溶液方法和表面等離子體共振（SPR）接近。并且在三對(duì)樣品測(cè)量中均獲得穩(wěn)定數(shù)據(jù)結(jié)果， Fida LD方法的其他的優(yōu)勢(shì)包括快速的優(yōu)化和測(cè)定、小樣本體積（納升-微升）以及附帶的全流程質(zhì)量控制（QC）。

FIDA LD的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)
LD對(duì)于專注于分子相互作用研究的科研人員具有無與倫比的優(yōu)勢(shì)：

1. 檢測(cè)其它技術(shù)無法檢測(cè)的：LD能夠檢測(cè)到其他測(cè)量或方法可能遺漏的微妙的波長位移。這種靈敏度的提高對(duì)于識(shí)別往往難以表征的復(fù)雜生物分子相互作用至關(guān)重要。

2. 效率：LD、BRIC、Rh同步進(jìn)行測(cè)量：您可以通過一次實(shí)驗(yàn)獲得三種測(cè)定結(jié)果。

3. 溶液動(dòng)力學(xué)：與傳統(tǒng)方法可能僅提供Kd確定不同，波長動(dòng)力學(xué)允許量化這些相互作用的動(dòng)力學(xué)，從而提供對(duì)當(dāng)前系統(tǒng)的更細(xì)致和深入的理解。

FIDA技術(shù)通過光譜位移（LD）、與結(jié)合依賴的強(qiáng)度變化（BRIC）和水動(dòng)力學(xué)半徑測(cè)量（R_h），為解析分子相互作用提供了獨(dú)特的三維視角，這些優(yōu)勢(shì)包括：

• 綜合的多維數(shù)據(jù)：FIDA通過同時(shí)測(cè)量這三個(gè)維度，能夠提供關(guān)于分子相互作用的更全面的理解。水動(dòng)力半徑（R_h）提供了分子或復(fù)合物的絕對(duì)大小，BRIC則敏感地捕捉到結(jié)合事件引起的熒光強(qiáng)度變化，而光譜位移（LD）則揭示了分子環(huán)境的微小變化。這種結(jié)合使研究人員能夠從多個(gè)角度評(píng)估分子行為。

• 高靈敏度和準(zhǔn)確性：FIDA的Rh可以檢測(cè)到低至1%的粒徑變化。BRIC則能夠識(shí)別在復(fù)雜生物環(huán)境中難以檢測(cè)的結(jié)合事件，而LD通過捕捉微小的光譜位移，進(jìn)一步提高了對(duì)相互作用動(dòng)態(tài)的敏感度。這種高度靈敏性使得研究人員能夠檢測(cè)到以前無法識(shí)別的復(fù)雜相互作用。

• 在原生條件下的分析：FIDA技術(shù)在恒定溫度下運(yùn)行，保持了生物分子的原生狀態(tài)。BRIC和LD技術(shù)確保了在不干擾樣品的情況下進(jìn)行測(cè)量，這對(duì)于維持樣品的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，特別是在復(fù)雜的生物介質(zhì)中（如血清或細(xì)胞裂解液）。

• 動(dòng)力學(xué)和親和力分析：通過波長變化，F(xiàn)IDA能夠提供關(guān)于結(jié)合動(dòng)力學(xué)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，這有助于研究人員了解相互作用的速率和穩(wěn)定性。同時(shí)，BRIC和Rh的結(jié)合也使得親

• 和力常數(shù)（Kd）測(cè)定更加準(zhǔn)確，揭示了分子之間的結(jié)合強(qiáng)度。

• 適用于復(fù)雜樣品：FIDA在處理復(fù)雜樣品時(shí)表現(xiàn)出色，其LD和BRIC能夠自動(dòng)扣除背景信號(hào)，確保從復(fù)雜的生物介質(zhì)中提取出有意義的信號(hào)。這使得FIDA在藥物開發(fā)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用及生物標(biāo)志物驗(yàn)證等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。

FIDA 平臺(tái)的選擇
FIDA平臺(tái)包括高通量、全自動(dòng)的納升移液主機(jī)，以及配置的獨(dú)立的三個(gè)光學(xué)模塊，分別是紫外光學(xué)模塊用于Labelfree檢測(cè)，以及藍(lán)色和紅色光學(xué)模塊，與其它技術(shù)不同的是，F(xiàn)IDA主機(jī)可以靈活的配置最多三個(gè)光學(xué)模塊，也可配置單獨(dú)模塊與用于特定的研究。FIDA配置的靈活性可以滿足您當(dāng)前的科研需求，而且方便的滿足后續(xù)的技術(shù)升級(jí)，最具特色的溶液自由動(dòng)力學(xué)模塊也可以作為選擇進(jìn)行靈活配置。

FIDA正在中國進(jìn)行火熱的DEMO測(cè)試，如果您有任何分子互作技術(shù)上難以解決的問題，都可以聯(lián)系我們，我們非常有信心，憑借第一性原理的技術(shù)以及獨(dú)特的多維驗(yàn)證技術(shù)，F(xiàn)IDA一定是您最值得信賴的互作技術(shù)！

關(guān)于文章的詳細(xì)內(nèi)容，請(qǐng)參考FIDA官方網(wǎng)站，鏈接是：
https://www.fidabio.com/blogs

參考文獻(xiàn)
FIDA
Demchenko, Alexander. (2010). The Concept of λ-Ratiometry in Fluorescence Sensing and Imaging. Journal of fluorescence. 20. 1099-128. 10.1007/s10895-010-0644-y.

Demchenko, Alexander. (2014). Practical aspects of wavelength ratiometry in the studies of intermolecular interactions. Journal of Molecular Structure. 1077. 10.1016/j.molstruc.2013.11.045.

Myszka, David. (2004). Analysis of small-molecule interactions using Biacore S51 technology. Analytical biochemistry. 329. 316-23. 10.1016/j.ab.2004.03.028.

Langer, A. et al. (2022). A New Spectral Shift-Based Method to Characterize Molecular Interactions. Assay and drug development technologies. 20. 10.1089/adt.2021.133.