共聚焦顯微鏡的理想光源

在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，共聚焦顯微鏡的完美光源應(yīng)該有何表現(xiàn)？它應(yīng)該有足夠的強(qiáng)度，可調(diào)諧的波長，以便同時(shí)激發(fā)一系列樣品。此外，它應(yīng)該成為熒光壽命實(shí)驗(yàn)的脈沖光源。這樣的光源已經(jīng)出現(xiàn)：白激光。它采用高能脈沖紅外光纖激光器經(jīng)過光子晶體光纖以產(chǎn)生連續(xù)光譜。通過聲光調(diào)制濾片從該連續(xù)光譜中選擇窄帶激光。這種儀器提供的光纖足夠強(qiáng)，可以像普通激光束一樣聚焦——這是衍射限制照明的必需要求。這樣就可以在光譜上從藍(lán)色持續(xù)調(diào)諧到紅色，可以同時(shí)提供八種可調(diào)諧波長的激光譜線。白激光可以通過脈沖能量發(fā)射帶來一些額外好處，它天生就是一個(gè)基于單光子熒光壽命成像的光源，它可以通過無濾片電子發(fā)射濾波來抑制檢測(cè)過程中的激發(fā)光干擾。

 

1、超連續(xù)譜白激光光源
經(jīng)典激光源通常僅提供單一的窄帶發(fā)射。有些氣體激光器可以同時(shí)發(fā)射幾種光線。最著名的例子是氬離子激光器，在藍(lán)綠范圍內(nèi)可以提供5條光線。其他激光器，例如染料激光器，雖然可以調(diào)諧，但一次僅能發(fā)射一種顏色。此外，染料激光器非常不穩(wěn)定，需要一些耐心才能保持正常運(yùn)行。有些固體激光器雖然可以調(diào)諧，但僅適用紅外波段（例如：Ti:Sa激光器）。除了精密度高和價(jià)格昂貴之外，他們同樣一次僅能發(fā)射單一波長的光線，而且調(diào)諧流程非常緩慢（需要好幾秒）。

隨著白激光的誕生，情況已經(jīng)完全改變，因?yàn)樗鼈兛梢栽诤艽蟮牟ǘ畏秶鷥?nèi)同時(shí)發(fā)射，而且在聚焦性能方面仍保持著激光的特性^[1]。

這些光源采用光纖式紅外激光器，發(fā)射約80兆赫的光脈沖。這種化合物稱為“種子”，即提供精確的時(shí)鐘，但能量比較低。脈沖隨后在采用二極管泵浦的激光放大器中放大。放大激光器同樣基于光纖，且兩個(gè)系統(tǒng)通過光纖拼接無縫耦合。該放大器的輸出紅外激光可以達(dá)到大約10瓦的平均功率，在80兆赫時(shí)，脈寬大約200ps。這些高能脈沖最終聚焦在所謂光子晶體光纖（PCF）的入口表面。這些光纖的主要特征是其中心位置有空心管的圖案。這種空心管圖案表面的強(qiáng)烈非線性處理，包括群速色散（4階）、自陡峭、拉曼散射和等離子裂變，導(dǎo)致單色光線擴(kuò)散到更為廣闊的光譜范圍，達(dá)到藍(lán)色，甚至紫外譜段。

根據(jù)PCF的長度，單色紅外波峰可以橫跨數(shù)百納米的光譜。典型光纖長度為0.5到2米。

圖1：左：光子晶體光纖截面。中心的空心管圖案就是復(fù)雜的非線性光子通過相互作用產(chǎn)生寬能譜光子的位置。

右圖：白激光由放大功率后的紅外脈沖激光通過光子晶體光纖所產(chǎn)生。PCF是一種超連續(xù)譜固體激光發(fā)生器。連續(xù)譜寬度取決于PCF的長度，外加許多其他工程細(xì)節(jié)。所有部件均基于光纖，因此天然免維護(hù)。圖示為PCF出口處的光譜由棱鏡產(chǎn)生并投射到一張紙上。

 

2、二維（波長和光強(qiáng)）聲光調(diào)制
與使用白色光源進(jìn)行熒光照明的其他顯微鏡一樣，白激光共聚焦顯微鏡^[2]需要一種方式選擇激發(fā)波長以激發(fā)不同的熒光染料。如有可能，多個(gè)激發(fā)波長能夠同時(shí)激發(fā)多重染色樣品更好。在寬場(chǎng)熒光顯微鏡中，這項(xiàng)工作由激發(fā)濾片執(zhí)行。具有三到四段帶通的二向色鏡可以用于多重染色樣品。

超連續(xù)譜中發(fā)出的光束可以提供更加全面的解決方案。聲光調(diào)制濾片可以從光譜中挑選一條譜線（實(shí)際上是窄條帶波）并將其偏轉(zhuǎn)到不同的方向。光譜的其他部分直接穿過水晶。條帶波的波長可以無極調(diào)諧，條帶的寬度大約1到3納米，具體寬度取決于其波長。此類條帶波的能量一般是幾毫瓦，但已經(jīng)足以用于成像，甚至經(jīng)常用于FRAP實(shí)驗(yàn)。通過增加更多電子驅(qū)動(dòng)器以便在晶體中產(chǎn)生機(jī)械波，同時(shí)可以輸出一系列顏色，最多可以同時(shí)產(chǎn)生八種波長的激發(fā)光（但并非技術(shù)上限）。這些條帶波的波長和強(qiáng)度均可調(diào)諧。

這一組合令白激光（WLL）成為共聚焦顯微鏡的理想光源。它適用于可見光范圍內(nèi)所有已知的可激發(fā)染料，并且可以記錄激發(fā)光譜來探索新染料的光譜性質(zhì)，尤其是原位光譜。此外，如果出于發(fā)射收集的原因或者為了改善相鄰染料的分離，它可以任意調(diào)諧以實(shí)現(xiàn)峰外激發(fā)。

圖2：采用聲光調(diào)制濾片從超連續(xù)譜光源的白光發(fā)射中提取出一系列不同色彩的條帶波。這些條帶波的顏色和強(qiáng)度均可調(diào)諧。對(duì)多重染色樣品進(jìn)行平行激發(fā)時(shí)，必須同時(shí)使用一系列條帶波。

 

3、只有聲光分光器（AOBS）能夠完成
激發(fā)波長的任意調(diào)諧不僅帶來了巨大好處，還有新的挑戰(zhàn)：什么設(shè)備可以將無極調(diào)諧的光線送進(jìn)熒光顯微鏡的光路？最簡單的方法就是使用二色分光鏡，但這樣做的代價(jià)是必定會(huì)損失一定比例的激發(fā)能量，盡管這只能算是一個(gè)小問題。該方法的一個(gè)嚴(yán)重缺陷是失去珍貴的發(fā)射光。即便使用80/20的二色分光鏡（通常會(huì)浪費(fèi)4/5的激光能量），也會(huì)犧牲五分之一的發(fā)射光。

單個(gè)分色鏡，即便有多個(gè)波段，顯然也不能支持可調(diào)諧光源的優(yōu)勢(shì)。采用單次發(fā)射的慢調(diào)諧非連續(xù)光源的方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商業(yè)應(yīng)用。該系統(tǒng)采用大約10個(gè)二向色鏡，每個(gè)均采用各自的工作頻率，在200種顏色范圍內(nèi)僅使用10種，而且可以用于指定波長的兩端之外這樣可以得到總共30種顏色，但顯然不夠完美。

完美解決這一困境的方法是使用聲光分束器可調(diào)諧聲光分束器（AOBS）^[3]這一設(shè)備允許將一系列彩色條帶波送進(jìn)光路，而將其余光譜引導(dǎo)至不同方向，效率超過95%。若采用多條帶波可調(diào)諧激光器，人們可以操作AOBS，以便所需激發(fā)譜線進(jìn)入激發(fā)光路。

之后，完整的發(fā)射光譜會(huì)被高效率地發(fā)送至檢測(cè)光路。將激發(fā)條帶波聚焦到樣品上所需的透射光譜空隙與條帶波本身的大小相同（因?yàn)樗鼈儾捎孟嗤�技術(shù)生成），并且可以在他們所處的位置同時(shí)控制：只要有人調(diào)諧激發(fā)波長，相應(yīng)的空隙就會(huì)同步進(jìn)行電子調(diào)諧。用戶不需要進(jìn)行任何操作。

因此，可調(diào)諧聲光分光器是可調(diào)諧多色激發(fā)的理想耦合設(shè)備。

圖3：使用可調(diào)諧光源時(shí)，僅有自由調(diào)諧分光設(shè)備可以有效充當(dāng)激發(fā)和發(fā)射的分光器。這種聲光分光器可以同時(shí)無極適應(yīng)任何給定系列的激發(fā)波長。

 

4、激發(fā)和發(fā)射光譜的強(qiáng)度和熒光壽命
光譜檢測(cè)器（SP）旨在對(duì)檢測(cè)到的發(fā)射波段的帶寬以及中心波長實(shí)現(xiàn)完全控制。這可以保證更高的通量（傳輸效率）以及優(yōu)化分離。除此之外，光譜檢測(cè)器還可以記錄發(fā)射光譜，不論是同時(shí)掃描（5通道）還是序列掃描（最多400個(gè)頻道），也可以是二者結(jié)合。過去，發(fā)射光譜與安裝在系統(tǒng)中的固定譜線激光器綁定在一起。有了白激光（WLL），這種情況完全改變了：由于顏色可以按照1納米的精度調(diào)諧，整個(gè)可見光譜內(nèi)都可獲得平滑的激發(fā)光譜。結(jié)合可以自動(dòng)控制匹配激發(fā)波長的光譜檢測(cè)器，這項(xiàng)測(cè)量工作可以完全自動(dòng)進(jìn)行。且這項(xiàng)工作只有通過聲光分光器來引導(dǎo)激發(fā)光和發(fā)射光才可以實(shí)現(xiàn)。

同時(shí)獲取了可調(diào)諧激發(fā)和可調(diào)諧發(fā)射之后，下一步是創(chuàng)建有關(guān)強(qiáng)度的二維關(guān)系圖^[4]。需要分離復(fù)雜的熒光染料混合物時(shí)，這種λ平方圖尤其有用。當(dāng)需要對(duì)熒光染料的特性進(jìn)行研究時(shí)，它同樣具有普遍的價(jià)值：無論是因?yàn)樗麄兪切掳l(fā)現(xiàn)或新設(shè)計(jì)的，還是是因?yàn)閷?duì)微環(huán)境條件引起的光譜變化。

熒光由發(fā)射強(qiáng)度和熒光壽命來表征。為精確衡量熒光壽命，需要脈沖光源。幸運(yùn)的是，白激光是一種脈沖光源，且脈沖頻率符合典型熒光壽命的要求（即在0.5到5納秒的范圍內(nèi)）。如果需要更長的脈沖間隔，也可以降低脈沖頻率。當(dāng)然，白激光的可調(diào)諧性可以直接顯示熒光壽命激發(fā)光譜，這包括下一個(gè)邏輯結(jié)果：二維激發(fā)-發(fā)射壽命圖。

圖4：記錄了6種不同顏色的混合珠粒。左圖：由激發(fā)-λ平方掃描記錄微球的偽彩色投影。右圖：激發(fā)-發(fā)射圖的偽三維視圖。我們可以輕松找到六種不同熒光染料的波峰（箭頭方向）

 

5、門控技術(shù)——全光譜電子屏蔽濾片
最后，這項(xiàng)最新技術(shù)還實(shí)現(xiàn)了一項(xiàng)功能。混合檢測(cè)器（HyD）擁有靈敏度高、速度快，動(dòng)態(tài)范圍大等特點(diǎn)。它還提供一種門控操作模式。通過與脈沖白激光結(jié)合，混合檢測(cè)器可以在光脈沖之間的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)熒光發(fā)射：只需設(shè)置HyD的門控時(shí)間以便在激光脈沖期間不收集信號(hào)。檢測(cè)到的信號(hào)只包含純熒光信號(hào)，并且不含任何反射光。通過這種方法，熒光顏色在與殘留反光的對(duì)抗時(shí)可以輕松獲勝。不需要通過為激發(fā)波長留出足夠的空間來限制發(fā)射收集。甚至有可能緊接著激發(fā)波長之前以及更遠(yuǎn)的位置進(jìn)行測(cè)量，這樣就可以表征反斯托克斯發(fā)射。

脈沖和可調(diào)諧光譜白激光光源，與可調(diào)諧聲光分光器、可調(diào)諧光譜檢測(cè)器以及門控混合檢測(cè)器結(jié)合，是極具吸引力的新技術(shù)的融合。雖然下面這段聽起來有點(diǎn)老套，但非常應(yīng)景：它徹底改變了共聚焦顯微鏡的設(shè)計(jì)理念和操作。

圖5：通過門控檢測(cè)，可以非常有效而且純粹地記錄來自樣品的熒光信號(hào)�；旌蠙z測(cè)器（HyD）可以作為這方面的理想傳感器。數(shù)據(jù)收集分散在整個(gè)激發(fā)脈沖期間，因此僅收集發(fā)射的熒光。左圖：記錄在492納米波長下激發(fā)時(shí)的綠色熒光發(fā)射收集490-600納米。主要信號(hào)是反射光，因?yàn)榧ぐl(fā)波長位于發(fā)射光收集波段內(nèi)。右圖：相同的激發(fā)波長和發(fā)射收集波段，但打開門控。沒有記錄反射光不論發(fā)射波段，僅接收純凈、清晰的熒光。

 

參考文獻(xiàn)：

1.Knight JC, Birks TA, Russell TS and Atkin DM: All-silica single-mode optical fiber with photonic crystal cladding. Opt. Lett 21 (1996) 1547–49.

2.Birk H and Storz R: Illuminating device and microscope US Pat. 6,611,643 (2001).

3.Birk H, Engelhardt J, Storz R, Hartmann N, Bradl J and Ulrich H: Programmable beam splitter for confocal laser scanning microscopy. Progress in biomedical optics and imaging SPIE 3:13 (2002) 16–27.

4.Borlinghaus R, Gugel H, Albertano P and Seyfried V: Closing the spectral gap – the transition from fixed-parameter fluorescence to tunable devices in confocal microscopy. Proc of SPIE 6090 (2006).

 

相關(guān)產(chǎn)品

STELLARIS共聚焦顯微鏡平臺(tái)

STELLARIS 8 Dive多光子共聚焦顯微鏡

 

了解更多：徠卡顯微