光片熒光顯微鏡簡介

光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種快速發(fā)展的體積成像技術(shù)，因其速度快、靈敏度高、光學分層能力強以及低光毒性和低光漂白而受到生命科學家的青睞。在LSFM中，生物標本被聚焦的光片照亮，熒光通過現(xiàn)代科學相機以寬視場格式捕獲。與傳統(tǒng)的表面熒光成像方法不同，LSFM限制了對焦區(qū)域以外的潛在有害照明，從而減少了光毒性和光漂白，提高了成像對比度。

在《Systematic and Quantitative Comparison of Lattice and Gaussian Light-Sheets》一文中，作者Bo-Jui Chang、Kevin M. Dean和Reto Fiolka 系統(tǒng)比較了基于不同光束光片的物理性質(zhì)。盡管近年來新的光束因其窄光腰和傳播不變特性受到關(guān)注，但關(guān)于其物理性質(zhì)及其與標準高斯光束相比的研究卻很少。本文通過實驗測量了最常用的方形光柵光片和高斯光片的光束特性，發(fā)現(xiàn)兩者在厚度、共焦參數(shù)、傳播長度和整體成像性能方面非常相似。本文旨在對這些研究結(jié)果進行解讀，明確其對光片熒光顯微鏡（LSFM）領(lǐng)域的研究人員和實踐者的影響。

 

關(guān)鍵概念和方法

這篇文章重點討論了兩種主要的光片類型：高斯光束和常用于LLSM的抖動方格光柵(dithered square lattice)。作者詳細介紹了生成和分析這些光片的實驗設(shè)置，包括使用488納米激光器、空間光調(diào)制器以及各種光學元件來成形和測量光片。

圖1.由方形光柵和高斯光片照明的3D圖像堆疊中的珠子在YX和YZ最大強度投影（MIP），傳播長度分別為(A) 12 μm, (B) 19 μm, (C) 32 μm 和 (D) 40 μm。

表格1. 方形光柵和高斯光片的橫向和軸向分辨率是通過100納米熒光納米球測量的。使用雙樣本T檢驗評估統(tǒng)計顯著性。

在40um 傳播長度處，高斯光束表現(xiàn)出更好的軸向分辨率。

 

光片特性的測量包括以下三個參數(shù)：

1、光束束腰處Z方向的光片厚度。

2、Y方向的光片傳播長度。

3、共焦參數(shù)，測量光片厚度增加到其最小值的√2倍的距離。

 

光片特性的比較

01、光束厚度和傳播長度

研究表明，高斯光片和方格光柵光片在光束腰厚度和傳播長度方面表現(xiàn)出相似的特性。這一發(fā)現(xiàn)具有重要意義，因為它挑戰(zhàn)了之前認為光柵光片由于其傳播不變性而具有更優(yōu)越的軸向分辨率的觀點。

圖2. 高斯光片和方形光片顯微鏡的點擴散函數(shù) (PSF) 和光學傳遞函數(shù) (OTF)。(A) 數(shù)值孔徑 (NA) 為 0.31、0.24 和 0.14 的高斯光片，以及數(shù)值孔徑為 0.70 和 0.56、0.55 和 0.44、0.35 和 0.28 的方形光片的光束輪廓。展示了 YZ 和 XZ 的橫截面視圖。每個光片在中心（最薄的腰部）的 XZ 視圖。箭頭指向有用光片邊緣和方形光片旁瓣的不同之處。NA：用于方形光片的環(huán)形外數(shù)值孔徑；na：用于方形光片的環(huán)形內(nèi)數(shù)值孔徑。(B) 沿傳播方向的光束大小測量。(C) 光片厚度的測量。

 

02、光學性能

作者細致地測量了兩種光片的點擴散函數(shù)（PSF）和光學傳遞函數(shù)（OTF）。

圖3. 方形光柵和高斯光片顯微鏡的點擴散函數(shù)（PSF）和光學傳遞函數(shù)（OTF）。所有PSF和OTF圖像均應用了0.8的伽馬校正，以增加弱特征的對比度。選擇具有類似共焦參數(shù)的高斯光片以與光柵光片進行比較。PSF的比例尺為1 μm。

結(jié)果表明，高斯光片和方格光柵光片具有相似的PSF和OTF，表明它們在實際應用中的成像性能幾乎沒有區(qū)別。

 

03、共焦參數(shù)

兩種光片在光片厚度與共焦參數(shù)之間表現(xiàn)出相似的關(guān)系。然而，由于生成和調(diào)節(jié)這些光束的復雜性，方格光柵光片表現(xiàn)出略大的可變性。

圖4. (A) 光片厚度與光片傳播長度的關(guān)系。厚度的測量方法如圖1(C)所述，傳播長度的測量方法如圖1(D)所述。(B) 光片厚度與共焦參數(shù)的關(guān)系。共焦參數(shù)的測量方法見原文。

 

實驗結(jié)果

研究表明，大多數(shù)LLSM實驗可以使用傳統(tǒng)的高斯光片完成，從而簡化了系統(tǒng)的組裝、對準和操作。此外，使用高斯光片所需的激光輸入功率更少，并且更容易實現(xiàn)多色同時激發(fā)。研究結(jié)果強調(diào)了線性光學中的基本物理定律，即隨著共焦參數(shù)的增加，光片厚度和旁瓣強度也會增加。

圖5. 寬場、高斯光片顯微鏡和方形光柵光片顯微鏡的PSF和OTF。為了增強弱特征的對比度，所有PSF和OTF圖像均應用了0.5的伽馬校正。沿OTF中心虛線的剖面圖（未進行伽馬校正）清晰顯示了OTF的支持范圍。PSF中的比例尺為1 μm。

 

實踐意義

研究結(jié)論表明，對于大多數(shù)LLSM應用，傳統(tǒng)的高斯光片與方格光柵光片的性能相當。這對LSFM系統(tǒng)的設(shè)計和使用具有實際意義，表明無需復雜的光柵配置，使用更簡單、更直觀的高斯光片即可實現(xiàn)類似的結(jié)果。

本文為熒光顯微技術(shù)領(lǐng)域做出了重要貢獻，提供了清晰且數(shù)據(jù)驅(qū)動的比較，可以指導未來光片成像技術(shù)的研究和發(fā)展。

 

參考文獻：

Chang, B-J., Dean, K. M., & Fiolka, R. (2020). Systematic and quantitative comparison of lattice and Gaussian light-sheets. Optics Express, 28(18), 27052-27065. DOI: 10.1364/OE.400164

 

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